[發明專利]一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201210230801.8
• 申請日: 2012-07-03
• 公開（公告）號: CN103524597A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 王斌;羅紅宇;李忠瑞;栗麗
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C07K5/097
• 分類號: C07K5/097;C07K7/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06;A61P39/06;A23L1/29;A23L1/305
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

1.一種用鯊魚醇溶蛋白制備的抗氧化肽，其特征在于該抗氧化鈦的氨基酸序列分別為Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS檢測給出分子離子峰m/z?476.40[M+H]⁺或者/和m/z?668.60[M+H]⁺。

2.一種權利要求1所述的抗氧化肽的制備方法，其特征在于步驟依次為：

1）以鯊魚醇溶蛋白作為原料，按固液比1g:5mL~1g:10mL，加入pH5~6磷酸鹽緩沖液，用HCl或NaOH調pH到5~7，得混合液；

2）將混合液溫度升至50~60℃攪拌預熱15min~20min，按照醇溶蛋白質量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解溫度為50~60℃，酶解時間1~3h；

3）將酶解產物先經滅酶處理得酶解液，再將酶解液依次脫鹽、超濾和層析，得到抗氧化肽。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶U/g。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3）中的滅酶處理為：將步驟2）所得的酶解產物升溫至90~100℃，并于此溫度保持10min～15min，再冷卻至10~20℃以終止酶反應，然后離心，取上清液作為酶解液。

5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3）的脫鹽、超濾和層析的具體過程為：

脫鹽：將得到的酶解液制成濃度為15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔樹脂層析柱進行脫鹽，然后用質量濃度60~80%乙醇進行解析，除去乙醇，濃縮液進行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；

超濾：將脫鹽酶解物干粉溶于pH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，于0.1MPa~0.15MPa的工作壓力和20℃~30℃的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于1kDa部分，得超濾酶解液；

層析：將超濾酶解液用pH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經過DEAE-52纖維素陰離子交換樹脂分離，用水、0.09~0.11mol/L、0.45~0.55mol/L和0.9~1.1mol/L?NaCl溶液進行洗脫，收集0.45~0.55mol/L?NaCl的洗脫組分，得離子交換酶解液；將離子交換酶解液用pH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成8~12mg/mL的溶液，經過凝膠柱層析分離，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收集所得的最高活性組，即凝膠制備酶解物；將凝膠制備酶解物用pH6.8~7.2磷酸鹽緩沖液配成0.9~1.1mg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進行純化，根據抗氧化活性得2個高活性抗氧化肽。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述大孔樹脂為D101。

7.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于所述凝膠柱層析分離中采用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25；所述反相高效液相色譜的條件為：色譜柱為Zorbax?C18，進樣量19~21μg；流動相：A水，含質量濃度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含質量濃度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脫：0-10min：100%A；10-50min：0-100%B；洗脫速度0.9~1.1ml/min；紫外檢測波長280nm。

8.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟1）的鯊魚醇溶蛋白的提取方法，包括以下步驟：

1）鯊魚的魚肉按1g:20mL~1g:30mL固液比加入質量濃度85%~95%的乙醇溶液，然后勻漿，在30℃~50℃溫度下動態提取80min~120min；

2）將提取液的pH值用NaOH調至8.5~10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調至質量濃度55%~65%，稀釋后的提取液在25℃下放置30min~40min，于4000~5000rpm離心20min~30min，收集上清液；

3）上清液中加入NaCl至質量濃度為5%~8%，鹽析10h~15h后，于4000~5000rpm離心10min~20min，收集沉淀；

4）沉淀用乙醚脫脂20h~30h，然后于10000~12000rpm離心10min~15min將乙醚去除、凍干，即得醇溶蛋白。

9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于所述鯊魚為路氏雙髻鯊。

10.一種權利要求1所述的抗氧化肽的應用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys對羥基自由基、ABTS自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用，而對DPPH自由基顯示出中等的清除活性；同時，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用和對β-胡蘿卜素亞油酸體系中產生的過氧化氫自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收優點，可以作為藥品、保健食品或者食品添加劑上應用。