[發明專利]一種口蹄疫純化疫苗的制備方法

有效

• 申請號: 201210230394.0
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN103374547A
• 公開（公告）日: 2013-10-30
• 發明（設計）人: 張澍;呂宏亮
• 申請（專利權）人: 北京健翔和牧生物科技有限公司;山西隆克爾生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/02;A61K39/135;A61P31/14
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.一種無血清或無動物源性成分的培養基，其特征在于每升所述的培養基中含有以下成分：350-400mg?L-丙氨酸，80-100mg?L-鹽酸精氨酸，250-300mg?L-天冬氨酸，50-90mg?L-鹽酸半胱氨酸，100-140mg?L-谷氨酸，25-75mg?L-精氨酸，80-120mgL-酪氨酸，110-150mg?L-纈氨酸，2.0-3.0Kg蔗糖，80-120mg枸緣酸鈉，7.0-8.0KgNaCl，280-320mg?KCl，180-220mg?CaCl₂以及15-25mg酚紅，蒸餾水補足1000ml。

2.如權利要求1所述的培養基，其特征在于每升所述的培養基中含有以下成分：380mg?L-丙氨酸，90mg?L-鹽酸精氨酸，280mg?L-天冬氨酸，70mg?L-鹽酸半胱氨酸，120mg?L-谷氨酸，50mg?L-精氨酸，100mg?L-酪氨酸，130mg?L-纈氨酸，2.5Kg蔗糖，100mg枸緣酸鈉，7.5Kg?NaCl，300mg?KCl，200mg?CaCl₂以及20mg酚紅，蒸餾水補足1000ml。

3.權利要求1或2所述的培養基在培養BHK-21細胞或BSR細胞中的應用。

4.一種口蹄疫純化疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）BHK-21細胞的培養：采用權利要求1或2所述的培養基對BHK-21細胞進行微載體懸浮培養；

（2）病毒接種與培養：步驟（1）中BHK-21細胞在生物反應器中培養6-7天后，停止攪拌，微載體沉入反應器底部，放出細胞培養液后，加入含有0.1%葡萄糖的MEM培養液，攪拌0.5-1.0h，放出洗液，加入口蹄疫病毒液，使每個細胞感染的病毒顆粒達0.1-0.5TCID₅₀，吸附一小時，補加培養液，培養72~96小時，進行收獲，同時用0.22μm的膜過濾，4℃保存；

（3）病毒的濃縮和純化：采用中空纖維柱對病毒液進行澄清、微濾、濃縮后，采用連續流蔗糖密度梯度離心或分子篩層析柱對濾液進行純化；

（4）病毒的滅活及疫苗的制備。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟（1）中所述的BHK-21細胞傳代在10個代次內。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于向步驟（1）中所述的培養基中加入Cytodex-3微載體，使微載體的濃度達5~8g/ml。

7.如權利要求4所述的方法，其特征在于步驟（2）中所述的口蹄疫病毒為A型口蹄疫病毒、O型口蹄疫病毒、C型口蹄疫病毒、SAT-1、SAT-2或SAT-3型口蹄疫病毒。

8.如權利要求4所述的方法，其特征在于生物反應器體積在750L以上，攪拌速度為25-45rpm，病毒培養溫度為35℃，溶氧20%，pH?7.4。

9.如權利要求4所述的方法，其特征在于采用中空纖維柱對病毒液進行50~200倍的超濾濃縮。

10.由權利要求4-9任一項所述的方法制備得到的口蹄疫純化疫苗。