[發明專利]一種血清總膽汁酸的測定試劑及檢測方法

有效

• 申請號: 201210230311.8
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102768190A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 張松平;姬曉元;蘇志國;王平
• 申請（專利權）人: 中國科學院過程工程研究所
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于血清總膽汁酸檢測的組合試劑A，其特征在于包含由Tris-HCl緩沖液、3α-羥基類固醇脫氫酶、氧化型輔酶NAD⁺或還原型輔酶NADH構成的試劑I；和由心肌黃酶、2,6-二氯酚靛酚DCPIP、Tris-HCl緩沖液構成的試劑II。

2.如權利要求1所述一種用于血清總膽汁酸檢測的組合試劑A，其特征在于所述的試劑I、試劑II中各組分含量：

試劑I中為氧化型輔酶NAD⁺時：

1）每升試劑I中各組分的含量：

3α-羥基類固醇脫氫酶：0.02-0.05g/L

氧化型輔酶NAD⁺：5-30mM

pH8.0的Tris-HCl緩沖液：50mM

2）每升試劑II中各組分的含量：

心肌黃酶：0.02-0.05g/L

DCPIP：0.2-0.5mM

pH8.0的Tris-HCl緩沖液：50mM

試劑I中為還原型輔酶NADH時：

1）每升試劑I中各組分的含量：

3α-羥基類固醇脫氫酶：0.005-0.05g/L

還原型輔酶NADH：0.5-1.0mM

pH8.0的Tris-HCl緩沖液：50mM

2）每升試劑II中各組分的含量：

心肌黃酶：0.005-0.05g/L

2,6-二氯酚靛酚：0.2-0.5mM

pH8.0的Tris-HCl緩沖液：50mM。

3.一種用于血清總膽汁酸檢測的測定方法，其特征在于將權利要求1所述的試劑I和試劑II按照等體積混合后，得到組合試劑A，將已知濃度的膽汁酸溶液樣品加入到A中，利用紫外分光光度法連續檢測600nm處吸光度的變化，計算出反應速率，繪制已知膽汁酸濃度和反應速率之間的工作曲線；將待檢測的含有膽汁酸的血清樣品加入到A中，同樣利用紫外分光光度法連續檢測600nm處吸光度的變化，計算出反應速率，即可根據工作曲線定量計算血清樣品中的總膽汁酸濃度。

4.一種用于血清總膽汁酸檢測的固定化組合試劑B，其特征在于制備步驟包括:

1）將一定質量的3α-羥基類固醇脫氫酶、心肌黃酶、還原型輔酶（NADH）或氧化型?輔酶（NAD⁺）溶解于水中得到組合試劑B溶液；將該組合試劑B溶液與甘油充分混合，其中溶液與甘油的體積比為10：90―5：95；將該混合液作為同軸共紡靜電紡絲的內相溶液，加入到微量進樣器中；

2）將一定質量高分子聚合物溶于有機溶劑中充分溶解，得到的透明溶液作為同軸共紡靜電紡絲的外相電紡液，加入到另一微量進樣器中，其中外相電紡液是溶于N,N-二甲基乙酰胺的重量百分比為10～30％的聚氨酯溶液、溶于N,N-甲基乙酰胺的重量百分比為10～30％的聚偏氟乙烯溶液、溶于氯仿的重量百分比為10～30％的聚乳酸溶液、溶于水的重量百分比為3～10％的聚環氧乙烷溶液、或溶于N,N-二甲基乙酰胺的苯乙烯馬來酸酐共聚物溶液；

3）將內、外相電紡液分別通過管線連接至同軸電紡噴絲頭的進液口，將噴絲頭的出液口與高壓電源的正極連接，用鋁箔紙或不銹鋼網連接至高壓電源的負極作為接收板；

4）利用兩臺注射泵分別控制內、外相電紡液的流速，進行同軸靜電紡絲，在接收板上得到具有中空結構的聚合物納米纖維，其中用于血清總膽汁酸檢測的組合試劑B被原位包埋在這種中空納米纖維的空腔中，從而制備出用于血清總膽汁酸檢測的固定化組合試劑B。

5.如權利要求4所述的用于血清總膽汁酸檢測的固定化組合試劑B，其特征在于所制備出的固定化組合試劑B具有無紡布膜的形態，原位包埋在中空納米纖維中的3α-羥基類固醇脫氫酶、心肌黃酶、還原型輔酶（NADH）或氧化型輔酶（NAD⁺）在中空納米纖維的腔室中，保持游離分散的狀態。

6.利用權利要求4所述的固定化組合試劑B進行膽汁酸檢測的方法，其特征在于：在含有已知濃度膽汁酸的Tris-HCl緩沖液中，添加DCPIP溶液使其終濃度為0.04mM，然后再加入所述步驟4）中所制備出的用于血清總膽汁酸檢測的固定化組合試劑B，采用分光光度計連續每隔30s檢測600nm處吸光度值的改變，計算出反應速率，繪制已知膽汁酸濃度和反應速率之間的工作曲線；在待檢測的含有膽汁酸的血清樣品中，添加DCPIP溶液使其終濃度為0.04mM，然后加入步驟4）中所制備出的用于血清總膽汁酸檢測的固定化組合試劑B，同樣利用紫外分光光度法連續檢測600nm處吸光度的變化，計算出反應速率，即可根據工作曲線定量計算血清樣品中的總膽汁酸濃度。?