[發明專利]基于酶切建庫雙末端測序的長度多態性標記的引物設計開發方法

有效

• 申請號: 201210230233.1
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN102831331A
• 公開（公告）日: 2012-12-19
• 發明（設計）人: 鄭澤群;任一;陶曄;胡秋萍;黃華生
• 申請（專利權）人: 上海美吉生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: G06F19/18
• 分類號: G06F19/18
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 張美娟

技術領域

本發明涉及一種基因組長度多態性標記的引物設計方法。具體為基于酶切建庫雙末端（Pair-end）測序的長度多態性標記的引物設計開發方法；在缺少參考序列的情況下，尋找到個體間的Indel標記，并能夠在兩端設計引物。屬于生物信息學技術領域。這對于缺少參考序列的非模式生物的研究具有重要的意義。?

背景技術

InDel(insertion-deletion)插入缺失標記，指的是兩種親本中在基因組上的差異，相對另一個親本而言，其中一個親本的基因組中有一定數量的核苷酸插入或缺失。Indel位點信息的獲得可以有許多重要的應用，如構建遺傳圖譜，基因分型，分子標記輔助育種，疾病檢測等。?

如今，第二代DNA測序技術是一種高通量低成本的測序技術，基本原理是邊合成邊測序。以solexa測序方法為例，先用物理方法將DNA鏈隨機打斷，然后在片段兩端加上特定接頭，接頭上有擴增引物序列。測序時，DNA聚合酶合成待測片段的互補鏈，通過檢測新合成堿基所攜帶的熒光信號讀取堿基序列，從而獲得待測片段的序列。?

第二代測序技術已經廣泛應用于生物科學的許多領域，特別?是研究一個物種不同個體之間的多態性。傳統Call?Indel標記的方法是將測序個體得到的短reads通過比對軟件比對回參考序列，從而得到測序個體的Indel信息。常見的流程有：使用BWA軟件將reads比對回參考序列，使用SAMtools軟件處理比對結果尋找Indel位點^1,2。大體過程如圖1所示。?

目前，有參考序列的物種都可以很方便的進行Indel標記的查找，并在兩端設計引物進行實驗驗證。但是對于那些非模式生物而言，基本上是不存在參考序列的。而在沒有參考序列的情況下，傳統尋找Indel標記的方法存在著技術上的瓶頸。?

1.Li?H.and?Durbin?R.(2009)Fast?and?accurate?short?read?alignment?with?Burrows-Wheeler?Transform.Bioinformatics,25:1754-60.[PMID:19451168]?

2.Li?H.*,Handsaker?B.*,Wysoker?A.,Fennell?T.,Ruan?J.,Homer?N.,Marth?G.,Abecasis?G.,Durbin?R.and?1000?Genome?Project?Data?Processing?Subgroup(2009)The?Sequence?alignment/map(SAM)format?and?SAMtools.Bioinformatics,25,2078-9.[PMID:19505943]?

RAD-PE測序技術采用了新的建庫方式(酶切建庫)，其測序具體過程如圖2所示，用限制性內切酶切斷DNA特定的位點，再用物理方法將酶切之后的DNA分子隨機打斷，通過瓊脂糖膠DNA分離技術挑選特定長度的DNA分子，然后在挑選出來的DNA末端添加特定的擴增接頭與測序接頭，從而構建上機文庫進行高通量測序。?

其中RAD測序方法為本領域公知的方法，例如可參考以下文獻：?

(1)Michael?R?Miller,Tressa?S?Atwood,B?Frank?Eames,et?al,RAD?marker?microarrays?enable?rapid?mapping?of?zebrafishmutations,Genome?Biology,2007,8(6):R105.1-R105.10;?

(2)Michael?R.Miller,Joseph?P.Dunham,Angel?Amores,et?al,Rapid??and?cost-effective?polymorphism?identificationand?genotyping?using?restriction?site?associated?DNA(RAD)markers,Genome?Research,2007，17，240-248；?

(3)Nathan?A.Baird1,Paul?D.Etter,Tressa?S.Atwood,et?al,Rapid?SNP?Discovery?and?Genetic?Mapping?Using?Sequenced?RAD?Markers,PLoS?ONE,2008,3(10),e3376,doi:10.1371/journal.pone.0003376.?