[發明專利]豬脂肪組織特異性表達基因plin啟動子及應用

無效

• 申請號: 201210229852.9
• 申請日: 2012-07-04
• 公開（公告）號: CN103421780A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 蔣思文;高瑞娟
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;A01K67/027
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及到豬中脂肪組織特異性表達基因plin的不同長度啟動子區域的分離鑒定及功能驗證。

背景技術

高等生物基因的表達受到細胞內外環境的精細調控，因而具有嚴格的時間及空間有序性。基因的表達調控是一個復雜且有序的過程，由多階段調控水平共同完成，這主要包括轉錄前、轉錄、轉錄后、翻譯、翻譯后五個水平。其中轉錄水平的調控是最關鍵的環節。啟動子是轉錄水平上一個重要的調控元件，是位于結構基因5′端上游區的DNA序列，可與眾多的轉錄因子相互作用調控基因的表達(武力，1999)。因此深入研究啟動子的結構、功能、作用模式等有利于我們更好的理解相應基因的功能及基因間的互作關系。

根據啟動子作用方式及功能的不同可將啟動子分為3類：組成型啟動子、誘導型啟動子和組織特異性啟動子。組成型啟動子是指在該類啟動子的調控下，基因的表達大體恒定在一定水平上，在不同組織部位表達水平沒有明顯差異。誘導型啟動子是指在某些特定物理或化學信號的刺激下，該種類型啟動子可以大幅度地提高基因的轉錄水平。組織特異性啟動子是指在該類啟動子的調控下，基因往往只在某些特定的器官或組織部位表達，并表現出發育調節的特征。

外源基因在機體中能否高效穩定地表達是基因工程研究的關鍵。在真核細胞中利用基因工程技術構建多種真核表達系統進行外源基因的表達已經是一項常用的技術，但是經常面臨的問題是外源基因的表達量較低，且表達往往存在于機體的幾乎所有組織中，如現階段廣泛利用的CMV及SV40啟動子。兩者均可以攜帶外源基因與幾乎所有類型的細胞中高效地表達。這兩種高效的啟動子存在的問題是顯而易見的：不具備調控基因靶向表達于某一特定組織的能力。能夠解決此問題的關鍵乃是具備較高活性的組織特異性啟動子的獲得。組織特異性啟動子通常以特定的組織細胞結構和化學、物理信號為基礎，可對外源基因進行靶向定位，將基因固定于某一組織或細胞中表達，減少了機體能量和物質的損耗及對機體代謝活動的影響，同時又能夠起到定向改善某一組織特性的效果，這在人類疾病的治療方面的前景尤其可觀。鑒于組織特異性啟動具備這樣的特質，在基因工程中越來越獲得研究者的青睞。

組織特異性的啟動子在動物機體中能夠啟動外源基因在特定的部位表達，保持特異性，這不僅克服了組成型啟動子因外源基因過度廣泛的表達而造成過度的浪費的缺點，并且能夠促使外源基因在某些特定的部位高效且特異性表達，具有明顯的時空特異性。

到目前為止對于組織特異性啟動子的研究也有了一些成果，最早開始是在植物方面的一些研究，從植物中成功分離了一些組織特異性啟動子，如：Sunikumar等人分離并且獲得了棉花α球蛋白B基因啟動子，將其同gus報告基因連接后，分別依次導入棉花、煙草和以及擬南芥中，經研究發現，報告基因僅表達于種子中，具有高度的組織特異性；（劉京鴿，2010）；在植物方面組織特異性啟動子的分離以后在植物的抗蟲、抗病、培育優良品種方面將會得到廣泛的應用。在動物方面的研究相對植物就滯后一點，但是還是有一定成效的，大部分還是出于對一些疾病的治療。

在獲得的這些組織特異性啟動子的同時也存在一些問題，如：特異性并不是很高；分離并且獲得應用的特異性啟動子并不是很多，限制了在基因工程中的應用；分離出來的啟動子活性很低等問題。我們想要提高組織特異性啟動子活性可以從以下幾個方面：（1）構建雙啟動子：有研究者構建了小鼠的SP啟動子的基礎上又加了CMV強啟動子，將重新構建好的啟動子稱雙啟動子，結果發現通過構建雙啟動子的方法可以提高外源基因在C2C12細胞中的表達水平（章倩倩，2007）。（2）構建嵌合啟動子：即將對同一組織有特異性的兩個或兩個以上不同的啟動子或調控元件組合在一起。最常用的方法是不斷地篩選多種組合的組織特異性元件，最后選出最理想的組合來使用。小鼠的骨骼肌α-肌動蛋白基因啟動子，TEF-1、MEF-1、MEF-2寡核苷酸隨機組合篩選出的活性最強的嵌合啟動子SP啟動子，可以將攜帶外源基因在骨骼肌中高效并且穩定的表達。

脂肪細胞脂解的過程是體內能量代謝的主要核心反應，即脂肪酶將甘油三酯水解的過程。脂滴核心為中性脂質，即膽固醇酯或甘油三酯等，外周圍被單層的磷脂分子包被著，其中單層的磷脂中存在著一些與脂滴相關的蛋白，這些蛋白的存在對脂滴的代謝過程及其脂滴的調節過程起到舉足輕重的作用(Greenberg?A,et?al.,1991)。有研究結果表明，在脂肪水解過程中脂酶會發生位置的變化，將從細胞液中轉移到脂滴的表面，在整個脂解反應過程中脂滴表面所存在的脂滴包被蛋白起到了至關重要作用（趙小玲，朱慶脂，2006）。