[發(fā)明專利]乳糖在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210229149.8
• 申請日: 2012-07-03
• 公開（公告）號: CN102719506A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 俞昌喜;楊漸;陳理;廖聯(lián)明;許盈
• 申請（專利權(quán)）人: 福建醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于乳糖應(yīng)用領(lǐng)域，尤其涉及乳糖（分子式C₁₂H₂₂O₁₁）在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1中的新用途。?

背景技術(shù)

人胰島素樣生長因子-1?(human?Insulin-like?growth?factor-1，hIGF-1)?是人體內(nèi)一種重要的促生長因子,具有許多生理學(xué)活性及潛在的藥用價值。近年來，hIGF-1在治療臨床疾病方面比較認(rèn)可的適應(yīng)癥包括Laron侏儒綜合征、糖尿病、胰島素抵抗綜合征等多種頑疾，并取得了良好的效果。因此其臨床應(yīng)用價值日益受到人們的重視，顯示出巨大的應(yīng)用潛力，hIGF-1的制備成為國內(nèi)外研發(fā)的熱點之一。?

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使hIGF-1的大量獲得成為可能，目前國際上已經(jīng)有人利用基因重組技術(shù)生產(chǎn)制備hIGF-1并作為藥物開發(fā)，美國Insmed公司使用原核大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)獲得hIGF-1，商品名為美卡舍明－林菲培（Mecasermin?Rinfabate），已獲得FDA批準(zhǔn)用于治療嚴(yán)重原發(fā)性hIGF-1缺乏患兒。近年來國內(nèi)關(guān)于hIGF-1體外表達(dá)的報道也不少，但大多為實驗室規(guī)模的研究，從我國國家食品藥品監(jiān)督管理局網(wǎng)站檢索得知，目前國內(nèi)尚無單位申報hIGF-1新藥。?

高密度細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（high?cell?density?cultivation，HCDC)即高密度發(fā)酵技術(shù)，是為大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白而發(fā)展起來的一門發(fā)酵工藝，與傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)相比，該技術(shù)可以減少培養(yǎng)體積、縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資等，從而達(dá)到降低生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率的目的，這為高效生產(chǎn)hIGF-1蛋白提供了新的思路。然而，國內(nèi)公開報道的關(guān)于hIGF-1蛋白基因工程菌高密度發(fā)酵的工藝尤其是在誘導(dǎo)劑的使用上還存在一定不足與缺陷。?

在乳糖操縱子調(diào)控機(jī)理基礎(chǔ)上設(shè)計和構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)常用的誘導(dǎo)劑是非代謝性乳糖類似物異丙基-β-D-巰基半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG），其誘導(dǎo)效率高，只需要少量即可對lacUV5與T7lac等強(qiáng)啟動子產(chǎn)生持久的誘導(dǎo)作用，從而高效表達(dá)重組蛋白。然而，IPTG對人體有潛在毒性且價格昂貴，應(yīng)用于基因工程新藥工業(yè)化生產(chǎn)存在成本較高及產(chǎn)品中的IPTG殘留可能造成人體損害等局限性，有些國家不提倡使用或甚至明文規(guī)定在工業(yè)化生產(chǎn)人重組蛋白質(zhì)的過程中不得使用IPTG，因此IPTG在基因工程新藥hIGF-1的工業(yè)化制備中的應(yīng)用受到限制。目前國內(nèi)公開報道的基于乳糖操縱子機(jī)理構(gòu)建的工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1使用的誘導(dǎo)劑均為IPTG，所以一般僅限于實驗室研究水平，難以實現(xiàn)進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。要構(gòu)建能夠進(jìn)一步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)并且具有成藥可能性的hIGF-1制備工藝，必須尋找在高密度發(fā)酵表達(dá)過程中能夠代替IPTG的誘導(dǎo)劑。?

乳糖（lactose）是一種無毒、價格低廉的二糖，易溶于水，有多種存在形式，商品化的乳糖主要以α-單水化合物形式存在，又稱為α-乳糖。作為原核細(xì)胞的常用碳源，乳糖對乳糖操縱子也具有天然的誘導(dǎo)作用，也可用于誘導(dǎo)宿主菌表達(dá)重組產(chǎn)物，但其誘導(dǎo)效率不如IPTG。近年來國內(nèi)外均有學(xué)者嘗試使用乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)外源蛋白在細(xì)菌中的表達(dá)，本課題組于國內(nèi)首次公開報道使用乳糖誘導(dǎo)大腸桿菌在搖瓶水平表達(dá)hIGF-1的研究[楊漸，俞昌喜，廖聯(lián)明，廖虹婷.乳糖誘導(dǎo)人胰島素樣生長因子-1在大腸桿菌中的表達(dá)，海峽藥學(xué)，2010，22（8）：248-252]，但乳糖在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1中作為誘導(dǎo)劑的應(yīng)用未見文獻(xiàn)報道。究其原因主要是乳糖本身可被細(xì)菌利用作為代謝能源，使用乳糖作為誘導(dǎo)劑，其作用機(jī)制較為復(fù)雜，誘導(dǎo)條件不容易掌握，需要對誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)時間、添加方式等誘導(dǎo)條件進(jìn)行探索研究后才能使其能夠穩(wěn)定高效誘導(dǎo)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1。?

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種乳糖尤其是以α-單水化合物形式存在的商品乳糖（即α-乳糖）乳糖在制備誘導(dǎo)重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1的誘導(dǎo)劑中的應(yīng)用，即在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1中作為誘導(dǎo)劑的使用方法，包括乳糖誘導(dǎo)劑量、誘導(dǎo)時機(jī)、誘導(dǎo)時長、添加方式等，即乳糖作為誘導(dǎo)劑在重組大腸桿菌高密度發(fā)酵表達(dá)hIGF-1中的應(yīng)用。?