[發明專利]適應全懸浮無血清培養的MDCK細胞系及其在培養流感病毒、生產流感病毒疫苗中的應用

有效

• 申請號: 201210224401.6
• 申請日: 2012-06-28
• 公開（公告）號: CN102816732A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 張澍;呂宏亮
• 申請（專利權）人: 北京健翔和牧生物科技有限公司;山西隆克爾生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;A61K39/145;A61P31/16;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發明涉及一種MDCK細胞系及其應用，特別涉及一種適應全懸浮無血清培養的MDCK細胞系及其在培養流感病毒、生產流感疫苗中的應用。本發明屬于生物技術領域。?

背景技術

流感病毒疫苗的制備經過了從動物組織器官到細胞培養的規模化發展過程，動物流感病毒的培養也經歷了從雞胚向哺乳細胞大規模培養，從哺乳動物細胞的微載體懸浮培養到全懸浮培養，從動物源血清的培養到無動物源血清或成分的培養的發展過程，并結合離心純化以及柱層析純化，使動物流感病毒或抗原生產方法的可控性提高，也減少了疫苗注射引起的應急反應。從采用的培養基上看，無動物源血清或成分的培養基使得在病毒培養或疫苗生產中遭受外源污染的風險降低。?

盡管這樣，常用的用于培養流感病毒的細胞系仍存在各種缺點，因此仍無法滿足目前生產流感病毒疫苗的需求，例如MDCK具有致癌性，Vero、PER-C6的病毒產量較低。因此研究一種安全，高產的細胞基質將是現行流感疫苗工藝研究的重要問題。?

發明內容

本發明提供了一株適應全懸浮無血清培養的MDCK細胞系，還提供了利用所述的細胞系培養流感病毒的方法。?

具體的，本發明采用了以下技術手段：?

本發明的一株適應全懸浮無血清培養的MDCK細胞系，命名為MDCK-ZL2012，分類命名為狗腎細胞，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCC?No.6210，保藏日期為2012年6月14日。?

本發明還提供了所述的MDCK細胞系在培養流感病毒和生產流感病毒疫苗中的應用。?

本發明的一種培養流感病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：?

（1）將所述的MDCK細胞系接種于無血清培養基中進行懸浮培養，得到MDCK細胞懸浮培養液；?

（2）當MDCK細胞懸浮培養液中的細胞密度達到1.0×10⁶~7.0×10⁷個/ml時，按照MOI?0.01-0.1接種流感病毒；?

（3）病毒液在32℃培養3-4天收獲病毒上清液，即得流感病毒液。?

在本發明中的一種培養流感病毒的方法中，其特征在于所述的流感病毒為人流感病毒、馬流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒或犬流感病毒。?

與現有技術相比，本發明的有益之處在于：?

1、本發明的一種適應全懸浮培養的細胞系能夠在無其它任何載體的情況下實現細胞的懸浮培養，因此實現了細胞培養密度的最大化，也減少了細胞培養的體積，減少了后續處理的勞動強度，使得各個細胞的產能等同或高出一般的貼壁培養，故而使生產流感病毒的效率提高，減少了時間和成本。?

2、本發明的一種細胞系能夠在無動物源性的血清或成分的培養基中生長，因而降低了培養動物流感病毒時的外源因子污染的風險和在疫苗使用引起的應急反應，也使后續病毒處理如澄清、微濾、超濾、純化等步驟更加簡單易行，減少了工作量，更易純化。?

附圖說明

圖1為MDCK-ZL2012的細胞生長曲線圖；?

圖2為不同感染復數接種流感病毒后流感病毒復制的情況。?

具體實施方式

下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。?

本實施例涉及的材料來源：?

1、細胞：MDCK細胞購自ATCC；?

2、病毒：禽流感病毒H5N2、禽流感病毒H1N1，A/鹽山/01/2012H5N1、A/唐山/02/2012，H5N1A/邢臺/03/2012購自中國疾病控制中心病毒病控制所。?

培養基MEM?HAM和F12培養基購買自Invitogen公司，酵母或豆類提取物購買自Invitogen公司?

實施例1適應全懸浮無血清培養的MDCK細胞系的制備?

1、MDCK細胞在無血清或無動物源性的成分的培養基進行適應和馴化，培養基是MEM?HAM和F₁₂培養基的混合物，其中加入1.5g/L?Na₂CO₃無機鹽以及4.0g/L（0.5-8g/L都可）的酵母或豆類提取物。?