[發明專利]能抑制口蹄疫病毒的shRNA轉基因重組質粒及其應用

有效

• 申請號: 201210223353.9
• 申請日: 2012-07-02
• 公開（公告）號: CN102703504A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 劉明秋;鄭兆鑫;曾溢滔;焦曄;嚴維耀
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于遺傳工程技術領域，具體涉及一種應用RNAi技術設計的抗口蹄疫病毒質粒載體，并用于哺乳動物轉基因抗病育種。

背景技術

家畜口蹄疫（Foot?and?mouth?disease，FMD）是當今世界上最為嚴重的家畜傳染病，主要危害豬、牛、羊等偶蹄類動物。世界動物衛生組織（OIE）將口蹄疫列為A類傳染病之首。多年來，口蹄疫在世界范圍內大規模爆發和流行，給畜牧業造成巨大經濟損失。根據免疫原性，口蹄疫病毒（Foot?and?mouth?disease?virus，FMDV）有A、O、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ及AsiaⅠ等共7個血清型。口蹄疫病毒各型之間無交叉免疫反應，一種類型的疫苗不能保護家畜免受另一種類型病毒的感染，已經發現在許多地區會有一個以上病毒流行。如果用一個型的疫苗免疫家畜，有很大的盲目性。為了克服這種免疫的局限性，研究具有廣譜抗口蹄疫病毒作用的制劑有重要的實踐意義。另外，由于FMDV的具有快速傳染性和強致病性的特點，給使用傳統的疫苗快速控制口蹄疫的流行帶來了障礙。

RNAi技術是科學研究領域近年來取得的重大成就之一，它最大的優點在于具有高度的有效性和特異性并且具有快速的防御與治療效果。它的作用在基因功能研究領域和各種疾病的治療領域尤其是病毒性疾病的治療領域已顯現出不可估量的價值，例如在抗艾滋病毒(HIV),丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰白質炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都發現，RNA干擾對于抑制這些病毒的復制具有較好的效果，可能為這類病毒病的治療創立新的、更有效的途徑。但是在自然界中，各種病毒都會存在不同突變株，口蹄疫病毒就有七種血清型和很多的變異株，這給口蹄疫病毒病的防治工作帶來了巨大的困難。另一方面，RNAi有效作用時間較短的特點也給其使用帶來一定的問題。在目前已有的科研報道中，RNAi必須在實際病毒感染前1-2天內接種動物才能獲得較為理想的抗病毒效果。此外，siRNA/shRNA能否到達口蹄疫病毒在動物體內感染與復制的部位就成為RNAi是否能夠高效的干擾靶基因進而抑制病毒的重要問題。

所以本發明選取了FMDV基因組中高度保守的區段作為靶序列，構建能同時表達兩種shRNA的轉基因質粒載體。再用轉基因技術將上述質粒轉入細胞或小鼠，使可傳代細胞和轉基因傳代動物產生抗FMDV感染能力。本發明為RNAi技術用于豬、牛、羊等家畜的抗病育種，培養轉基因的抗口蹄疫病毒感染的家畜提供新的技術路線。

發明內容

本發明目的是提供一種能高效的抗口蹄疫病毒重組質粒，該重組質粒能通過不同的方法抑制同一型中不同毒株或者不同型的口蹄疫病毒在動物細胞和個體中的復制與感染。本發明的另一目的是提供該抗口蹄疫病毒重組質粒在轉基因育種中的應用。

本發明提出的抗口蹄疫病毒重組質粒，記為PB-EN3D2B，該質粒含有兩個shRNA表達基因，能同時編碼兩種分別靶向口蹄疫病毒基因組3D?RNA聚合酶和2B非結構蛋白保守區域的特異shRNA；其中，所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中3D基因；所述兩個shRNA表達基因中一個能表達抗口蹄疫病毒的shRNA，該shRNA靶向口蹄疫病毒基因組中2B基因；兩個shRNA表達基因呈串聯狀態。

本發明提供的的抗口蹄疫病毒重組質粒，其中，在兩個shRNA表達基因之間還可插入如報告基因之類的其他基因，得到具有同樣抗口蹄疫病毒功能的衍生重組質粒。

本發明中，所選擇的保守區基因3D和2B來自任何一型的口蹄疫病毒，如O型、A型、亞洲I型等。

本發明提供的PB-EN3D2B，其表達的shRNA序列是以各個血清型、各個亞型、不同毒株的基因組序列為基準，選取FMDV中特異的3D和2B基因為干擾靶點設計得到的。將該重組質粒通過PB轉座子或者直接轉染的辦法整合入組織培養細胞或動物的基因組，獲得單克隆轉基因細胞系或者轉基因動物家系。特定的轉基因細胞系或轉基因動物家系可以有效地抵抗不同型FMDV的復制與感染，如抵抗O型、A型、亞洲I型等復制與感染?。