[發(fā)明專利]C型口蹄疫病毒快速檢測(cè)試劑盒

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210221684.9
• 申請(qǐng)日: 2012-06-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102776294A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永生;張杰;丁耀忠;周建華;陳豪泰;馬麗娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，確切講是一種用于檢測(cè)牛或豬或羊以及相關(guān)牛或豬或羊的產(chǎn)品是否感染C型口蹄疫病毒的試劑盒。

背景技術(shù)

口蹄疫(Foot?and?mouth?disease，F(xiàn)MD)是一種由口蹄疫病毒（Foot?and?mouth?disease?virus，F(xiàn)MDV)引起的危害牛、豬、羊等偶蹄動(dòng)物的嚴(yán)重的急性熱性高度接觸性傳染病。由于其傳播速度快，不易控制和消滅，嚴(yán)重危害世界動(dòng)物貿(mào)易，被世界衛(wèi)生組織列為必須上報(bào)傳染病之一。

口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科（picornaviridas）中的口蹄疫病毒屬（aphthavirus）。共包括A、C、O、Asia?I、SAT?I、SAT?II及SAT?III型7個(gè)血清型，各血清型之間無(wú)交叉保護(hù)力。FMDV的病毒粒子直徑20-25nm，為正二十面體結(jié)構(gòu)，近似圓形；基因組為全長(zhǎng)8,500（nt）的正鏈RNA，包括一個(gè)開(kāi)放閱讀框（open?reading?frame，ORF），5’-非編碼區(qū)（5’-Untraslated?Region，5’-UTR）和3’-非編碼區(qū)（3’-Untraslated?Region，3’-UTR）；ORF編碼病毒多聚蛋白，依賴于自身編碼的蛋白酶（L、2A、3C）及少數(shù)的宿主因子，在經(jīng)過(guò)3級(jí)裂解后，形成4種病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP4、?VP2、VP3和VP1）和9?種非結(jié)構(gòu)蛋白（Lab、Lb、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D）；四種結(jié)構(gòu)蛋白各60分子構(gòu)成病毒顆粒，?VP1靠近由五個(gè)原粒組成病毒表面的小洞，VP2和VP3位于遠(yuǎn)端，VP4則完全位于衣殼里面。

盡管目前國(guó)內(nèi)外對(duì)口蹄疫的病原學(xué)、血清分型、診斷做了大量的研究，但口蹄疫病毒幾乎遍及世界各地，口蹄疫對(duì)偶蹄類經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的威脅眾所周知，它的發(fā)病率和造成的經(jīng)濟(jì)至今仍為各類傳染病之首。為了確定口蹄疫是否在某一地區(qū)存在，檢測(cè)動(dòng)物血清抗體的方法并非完全可靠，還必須通過(guò)通過(guò)病原學(xué)檢測(cè)以確診病原的存在。一般檢測(cè)方法為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清型診斷技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等診斷技術(shù)，但是這些方法有的敏感性不高、有的特異性不強(qiáng)、有的檢出率較低，即使病毒分離技術(shù)被認(rèn)為是檢測(cè)口蹄疫的金標(biāo)準(zhǔn)，但其確認(rèn)結(jié)果至少需要7天，檢測(cè)周期太長(zhǎng)，并且這些技術(shù)普遍費(fèi)用太高，存在二次散毒的隱患，一般基層很難開(kāi)展此項(xiàng)工作。C型口蹄疫在我國(guó)周邊亞洲地區(qū)具有流行史，對(duì)我國(guó)威脅較大。因此我們實(shí)驗(yàn)室利用在60年代從前蘇聯(lián)引進(jìn)的C型口蹄疫毒株建立了一種快速診斷C型口蹄疫的診斷技術(shù)，完成對(duì)C型口蹄疫病毒的診斷和監(jiān)控，對(duì)于防止其傳入我國(guó)具有重要的戰(zhàn)略意義。

中國(guó)發(fā)明專利200810034124.6公開(kāi)一種用于檢測(cè)O型口蹄疫病毒的LAMP試劑盒，該試劑盒由包含有六條LAMP引物的LAMP反應(yīng)液構(gòu)成的檢測(cè)體系構(gòu)成。由于該專利的試劑盒中有六條引物，因此其制造成本與使用成本相對(duì)較大。其次，該專利使用中需要定時(shí)定量?jī)x器，這使其應(yīng)用受到很大限制。第三，使用該專利檢測(cè)時(shí)只能得到兩條電泳條帶，這影響其檢測(cè)靈敏度，并易造成檢測(cè)結(jié)果識(shí)別的困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，能進(jìn)行快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)，具有較高靈敏度和更好經(jīng)濟(jì)性能的可檢測(cè)出被檢測(cè)?；蜇i或羊，或?；蜇i或羊的產(chǎn)品是否感染C型口蹄疫病毒的試劑盒。

本發(fā)明的C型口蹄疫病毒快速檢測(cè)試劑盒中包括有兩對(duì)LAMP引物，這兩對(duì)引物分別是SEQ1、SEQ2、SEQ3和SEQ4，即：

?表1?本發(fā)明的試劑盒中的引物

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采用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒，是從待檢動(dòng)物的器官拭子或OP液或血液或動(dòng)物死體組織中提取其全基因組RNA，再以RNA為模板，以試劑盒中的特異性C型口蹄疫的引物進(jìn)行多重RT-PCR，再對(duì)得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳圖譜分析被檢動(dòng)物是否感染有C型口蹄疫病毒。

本發(fā)明在應(yīng)用中先應(yīng)先將從待檢動(dòng)物的器官拭子或OP液或血液或病死動(dòng)物的組織用生理鹽水稀釋或研磨成1:5的乳懸液，全基因組RNA提取的方法采用RNA/DNA試劑盒提取法，然后再進(jìn)行后續(xù)處理。