[發明專利]一種角膜緣組織的保存方法

有效

• 申請號: 201210220833.X
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102726370A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 吳護平;董諾;李程;劉祖國
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬廈門眼科中心
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 廈門市新華專利商標代理有限公司 35203
• 代理人: 朱凌

技術領域

本發明涉及移植材料的保存領域，更具體的說涉及一種角膜緣組織的保存方法。

背景技術

角膜緣組織在許多在角膜緣上皮干細胞缺乏(limbal?stem?cell?deficiency)或功能障礙（limbal?stem?cell?dysfunction）、邊緣角膜變性和角膜緣腫瘤等疾病中被廣泛應用。在該治療中重要問題之一是從供體取出角膜緣組織并予以保持使之存活。

1992年，Kaufman報告了Optisol角膜活性保存液，使眼庫對角膜片的保存在2-3周內應用安全可靠，成為全世界眼庫保存角膜片行穿透性角膜移植首選采用的保存液，而在國內主要是應用2-4°濕房保存法。傳統的角膜移植以穿透性角膜移植術（penetrating?keratoplasty，PKP）為主流術式，為考慮角膜植片滿足穿透性角膜移植而側重于提供角膜活性好內皮，即角膜保存的關鍵是保存角膜內皮細胞的活性，因此關于角膜保存液成分的改良研究主要是圍繞著如何提高角膜內皮細胞活性而進行的。

隨著手術技術的進步、醫療器械的發展，臨床上角膜移植手術逐漸向成分角膜移植方向發展，即只移植患者角膜中發生病變的上皮、基質或內皮部分，如角膜緣干細胞、角膜上皮移植、板層角膜基質移植、帶內皮的板層基質移植，以及單純內皮移植等，顯著拓寬了適應癥，術后并發癥少，光學效果更好，但也給成分角膜的保存帶來了一些新的挑戰。傳統角膜材料在保存期間，會失去上皮，甚至損傷基底膜，一定程度上限制了角膜緣活性組織的臨床應用。

角膜緣組織是角膜與結膜、鞏膜之間的一個區帶，角膜緣的解剖結構與角膜不同，主要由上皮細胞層、疏松纖維組織層和主質層構成，其表面不光滑，有很多放射狀突起，自鞏膜緣開始到角膜逐漸消失?？紤]到角膜緣上皮基底層，則存在有上皮干細胞、黑色素細胞、郎罕氏細胞等。在角膜緣上皮與基質之間有膠原、整合素、N-鈣黏素等。而在角膜緣基質，則含有豐富血管、淋巴管和神經，從而給予角膜緣組織提供充分的營養。因此為保存角膜緣組織最大活性，需要盡最大可能模擬角膜的生理環境并提供所需的營養物質。

發明內容

本發明的目的在于提供一種角膜緣組織的保存方法，其保存的角膜緣組織生物學特性與新鮮角膜緣接近、上皮結構完整、生物活性高、凋亡細胞上皮破壞少、易于手術操作、無異常分化、運輸及保存方便，能被廣大患者接受并應用于臨床。

為了達成上述目的，本發明的解決方案是：

一種角膜緣組織的保存方法，其中，包括對新鮮角膜緣組織進行消毒的步驟以及對消毒后的新鮮角膜緣組織進行空氣暴露保存的步驟。

進一步，該對新鮮角膜緣組織進行消毒的步驟是將新鮮角膜緣組織用含抗菌素的磷酸鹽緩沖液浸泡和沖洗，浸泡時間為5-10min，沖洗至少3次，每次大于或等于5min。

進一步，該抗菌素選自5萬U/L青霉素、8萬U/L妥布霉素、100mg/L鏈霉素中的一種或兩種以上的組合。

進一步，該空氣暴露保存的步驟是將新鮮角膜緣組織置于可透水的鋪膜上，該鋪膜下為可提供角膜緣組織營養成分的保存液或細胞培養基，角膜上皮則直接與空氣接觸，該空氣暴露保存的培養環境溫度為0-37℃，氧氣濃度為0-20%。

進一步，該鋪膜選擇硝酸纖維素膜、乙酸纖維素膜或微孔濾膜中的一種。

進一步，該鋪膜中的孔徑選自0.1μm～5.0μm，厚度為100-140μm。

進一步，該保存液或細胞培養基選自Optisol中期保存液、DMEM培養基、SHEM培養基、血清或多種細胞因子中的一種或多種。

采用上述結構后，本發明對角膜緣組織進行的保存是直接采用空氣暴露保存的方式，其模擬了正常生理淚眼環境，其與傳統浸沒保存相比，角膜緣組織結構保存更完整，角膜上皮不會出現明顯凋亡，角膜緣干細胞能保持較高活性，并且還具有制作流程簡單、可靠、易于實施和成本低等功效。

附圖說明

圖1為本發明涉及一種角膜緣組織的保存方法的流程示意圖；

圖2為角膜緣組織采用本發明涉及保存方法與傳統浸沒保存方法后的狀態對比示意圖；

圖3為角膜緣組織采用本發明涉及保存方法后的免疫熒光染色分析圖；

圖4為角膜緣組織采用本發明涉及保存方法后的免疫熒光染色和免疫組織化學染色分析圖；

圖5為角膜緣組織采用本發明涉及保存方法后的TUNEL熒光染色分析圖；

圖6A和圖6B分別為角膜緣組織采用本發明涉及保存方法后的細胞克隆培養和技術分析圖；