[發(fā)明專利]無致病性的重組減毒狂犬病毒株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210220784.X
• 申請(qǐng)日: 2012-06-28
• 公開（公告）號(hào): CN102796710A
• 公開（公告）日: 2012-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 呂宏亮;張澍;高斌戰(zhàn)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京健翔和牧生物科技有限公司;山西隆克爾生物制藥有限公司
• 主分類號(hào): C12N7/01
• 分類號(hào): C12N7/01;C12N15/85;A61K39/205;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株無致病性的重組減毒狂犬病毒株，還涉及該病毒株的構(gòu)建方法和應(yīng)用，本發(fā)明利用逆向分子生物技術(shù)設(shè)計(jì)重組活疫苗，在細(xì)胞基質(zhì)中增殖，經(jīng)冷凍干燥可制備高效的狂犬病疫苗。本發(fā)明屬于生物疫苗領(lǐng)域。

背景技術(shù)

狂犬病病毒屬于彈狀病毒科，是一種不分階段RNA病毒，其基因組編碼五種蛋白:RNA依賴的RNA酶（L），核蛋白（N）、磷酸蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、外膜蛋白（G）。

狂犬病通過動(dòng)物咬傷或抓傷傳播，沿外圍神經(jīng)至神經(jīng)中樞引起細(xì)胞功能損傷和感染動(dòng)物的死亡，可逃避免疫識(shí)別。

機(jī)體抗狂犬病毒的免疫主要是狂犬病病毒糖蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的中和抗體和CD₄⁺、CD₈⁺細(xì)胞免疫。機(jī)體內(nèi)在的防御機(jī)制在狂犬病免疫應(yīng)答也重要作用，包括活疫苗L、N和P蛋白引起的保護(hù)性免疫。

抗病毒免疫與致病性相關(guān)，與病毒糖蛋白表達(dá)水平相關(guān)，盡管糖蛋白表達(dá)水平與免疫增效的關(guān)系不甚清楚，但糖蛋白基因保留了非嗜神經(jīng)性基因片段和高效復(fù)制的基因片段，使重組活病毒具有更高效的安全性和免疫原性，與傳統(tǒng)活疫苗相比，用該重組病毒生產(chǎn)的疫苗具有安全、高效、低廉、方便使用的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明利用逆向遺傳學(xué)技術(shù)，對(duì)國內(nèi)外的減毒活疫苗株進(jìn)行定向突變，降低了減毒疫苗株的致病性，提高了病毒在細(xì)胞基質(zhì)中的復(fù)制水平，因而增強(qiáng)了免疫原性和病毒基因的穩(wěn)定性。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

首先，本發(fā)明提供了一種制備無致病性的重組減毒狂犬病毒的方法，其特征在于將狂犬病毒基因組中的糖蛋白基因進(jìn)行以下位點(diǎn)的突變：Arg333→Gln，Asp164→Ser。即將狂犬病毒基因組中的糖蛋白基因中的第333位的Arg突變?yōu)镚ln，將位于第164位的Asp突變?yōu)镾er。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，是使所述的重組減毒狂犬病毒基因組中包含兩個(gè)拷貝的含有以下位點(diǎn)突變的糖蛋白基因：Arg333→Gln，Asp164→Ser。

在本發(fā)明所述的方法中，優(yōu)選的，所述的重組減毒狂犬病毒糖蛋白基因來自狂犬病毒CTN-1株、aG株、SAD株、EAR株、Flurg-LEP株、Flurg-HEP株或PM株。

無致病狂犬病病毒的G基因上的333位以及164位的位點(diǎn)突變導(dǎo)致G蛋白基因穩(wěn)定，不易返祖。

其次，本發(fā)明提供了由以上任一所述的方法制備得到的無致病性的重組減毒狂犬病毒。

按照本發(fā)明所述的方法制備得到了一株無致病性的重組減毒狂犬病毒，該病毒在免疫缺陷的動(dòng)物中傳一代或多代無致病性；本發(fā)明的一株無致病性的重組減毒狂犬病毒，含有雙拷貝的G基因，且G基因中存在以下位點(diǎn)的突變：Arg333→Gln，Asp164→Ser，該病毒株命名為CTN-GAGA，分類命名為重組減毒狂犬病毒，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號(hào)為：CGMCC?No.6209，保藏日期為2012年6月14日。

再次，本發(fā)明還提供了所述的重組狂犬病毒在制備預(yù)防由狂犬病毒引起的疾病藥物中的應(yīng)用。

其中，優(yōu)選的，所述的藥物可包括注射制劑和口服制劑。

本發(fā)明的藥物可口服，也可注射，口服制劑包括加餌料，注射制劑可通過包括肌肉、腦內(nèi)、皮下腹腔進(jìn)行注射。

最后，本發(fā)明還提供了一種疫苗組合物，其特征在于含有以上任一所述的重組狂犬病毒。

優(yōu)選的，所述的疫苗為凍干疫苗，其還包括藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體。

優(yōu)選的，所述的疫苗可用于包括狗、貓、狼、狐貍或松鼠等在內(nèi)的動(dòng)物的免疫。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明具體實(shí)施例所涉及的材料來源：

病毒株：狂犬病毒CTN1株、CVS-11株購買自中國生物制品檢定所。

實(shí)施例1狂犬病毒全長cDNA克隆