[發明專利]趨化因子受體9基因作為牛優良超數排卵性狀分子標記的鑒定方法及其應用

有效

• 申請號: 201210219621.X
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102732514A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 張嘉保;鄧瓊;姜昊;余文莉;李樹靜;陳承禎;俞先鋒;袁寶;張國梁;賈麗坤
• 申請（專利權）人: 吉林大學;北京安伯胚胎生物技術中心;吉林黑毛牛業有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68
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技術領域

本發明屬于動物基因工程技術領域，具體涉及牛趨化因子受體9基因片段的克隆以及其在牛超數排卵性狀標記輔助選擇中的應用。

背景技術

Mapletoft等(Mapletoft?RJ等，Assisted?reproductive?technologies?in?cattle：a?review.Rev?Sci?Technol?2005，24：393-403)報道，超數排卵在人類及動物胚胎移植領域是最有意義的技術之一，已被應用多年。此技術更是全世界范圍內牛胚胎生產及胚胎移植的重要組成部分。全世界范圍內每年有超過50萬枚胚胎是通過此技術獲得的。在牛胚胎移植過程中，多選擇正常發育的桑葚胚(Morula)檔次以上的可用胚胎(優質的桑葚胚和囊胚)進行移植。因此，利用此技術獲得更多的可用胚胎，對牛胚胎生產和移植具有重要的意義。

Mapletoft等(Mapletoft?R?J等，Recent?advances?in?the?superovulation?in?cattle.Reprod?Nutr?Dev?2002，42：601-611)報道，遺傳因素可能是影響超數排卵效果的因素之一。Fauser等(Fauser?B?C等，Predictors?of?ovarian?response：progress?towards?individualized?treatment?in?ovulation?induction?and?ovarian?stimulation.Hum?Reprod?Update?2008，14：1-14)報道，候選基因的單核苷酸遺傳多態性可能成為預測卵巢反應的首選因素。

趨化因子是與其同源受體結構非常類似的趨化肽。趨化因子受體在各種細胞中均有表達，包括神經元細胞、星形膠質細胞、小膠質細胞、上皮細胞以及內皮細胞中。另據Huang?Y等報道(Huang?Y等，Chemokine?CXCL16，a?scavenger?receptor.induces?proliferation?and?invasion?of?firsttrimester?human?trophoblast?cells?in?an?autocrine?manner.Hum?Reprod?2006，21：1083-1091)，侵入性滋養細胞也能表達趨化因子受體。因此，趨化因子受體9(CCR9)基因可以被選定為候選基因，其單核苷酸遺傳多態性可能為動物繁殖和生產性能的輔助選擇提供分子標記。

發明內容

本發明的目的在于克隆牛趨化因子受體9(CCR9)基因片段，鑒定其特定的突變位點以作為牛優良超數排卵性能相關基因多態性的檢測方法，為牛標記輔助育種提供一種有意義的分子標記。

本發明通過以下技術方案實現：

一種通過特異性引物和PCR(Polymerase?Chain?Reaction)方法獲得的牛超數排卵性狀相關基因趨化因子受體9(CCR9)的374bp序列，如表SEQ?ID?NO：1所示。

所獲得CCR9基因片段的DNA下列中有如表SEQ?ID?NO：1所述的A137-G137的堿基突變，導致AluI-RFLP(Restriction?Fragment?Length?Polymorphism)多態性的產生。

一種篩選適用于牛優良超數排卵性能相關的分子標記的方法，按照以下步驟制備：

通過設計特異性引物一對，其中正向引物CCR9-F：5’-CACAGCCTTTTGGGGTTGGA-3’和反向引物CCR9-R：5’-CGAGAAAGAGAAGGTCAGCGATGG-3’，從牛血液中提取基因組DNA，進行PCR擴增。由于PCR產物片段的DNA序列第137位存在A-G的堿基突變，導致AluI-RFLP多態性的產生，利用限制性內切酶AluI可進行此突變位點的檢測。

PCR產物的酶切產物可利用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，將檢測結果所示的不同基因型與牛超數排卵性狀關聯分析。結果表明，具備特定的基因型的個體將得到更好超數排卵效果。

以下對本發明作詳細的描述：

一、牛趨化因子受體9(CCR9)基因片段的克隆

設計一對特異性引物。建立PCR反應條件，具體情況如下：

CCR9-F：5’-CACAGCCTTTTGGGGTTGGA-3’(正向引物)

CCR9-R：5’-CGAGAAAGAGAAGGTCAGCGATGG-3’(反向引物)