[發明專利]一種濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈及其鑒別方法

無效

• 申請號: 201210219469.5
• 申請日: 2012-06-28
• 公開（公告）號: CN102768132A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 李錚;楊剛龍;馬恬然;王秦哲
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/34;G01N27/64
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

1.一種濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，包括以下步驟：

（1）蛋白樣品的預處理

取蛋白樣品加入超濾管并置于配套的離心管中，進行離心，再加入弱堿性清洗液，再次離心從而盡可能去除雜質；另取一離心管，將8～12KD的超濾管倒置于該離心管中，然后離心，收集離出的蛋白，用Bradford方法定量，最后定容至1～5mg/ml，即得到定容的蛋白溶液；

（2）定容的蛋白溶液中糖蛋白全O-連接糖鏈分離

將定容的蛋白溶液加入另一8～12KD的超濾管并置于配套的離心管中，進行離心，加入等體積的16M尿素溶液，振蕩混合，離心；再加入8M尿素溶液至超濾管中，離心，棄去收集管中的流出液；然后加入10～100mM的DTT（二硫蘇糖醇）溶液并振蕩混合，56℃靜置孵育，離心；再加入10～100mM的IAM(碘乙酰胺)或IAA（碘乙酸）溶液并振蕩混合，暗處靜置孵育，離心；再加8M尿素溶液至超濾管中，離心，至少重復1次；然后加反應緩沖液至超濾管中，離心，至少重復1次；加入1M?NaBH₄/0.05M?NaOH溶液（即NaBH₄和NaOH的混合水溶液，其中NaBH₄的終濃度為1M，NaOH的終濃度為0.05M）；再經過40～50℃水浴后，離心；再加超純水至超濾管中后離心，收集流出液，即得到已分離的糖蛋白全O-連接糖鏈；再用冰醋酸調節pH值至中性后，冷凍干燥備用。

2.根據權利要求1所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，其特征在于：所有的超濾管均采用10KD濾膜。

3.根據權利要求2所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（1）所述的弱堿性清洗液采用40mM?NH₄HCO₃或者NH₄AC溶液。

4.根據權利要求1至3任一所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中所述反應緩沖液采用10～100mMNH₄HCO₃或NH₄AC溶液。

5.根據權利要求4所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中所述加入超純水至超濾管中后離心并收集流出液的操作，重復一次。

6.根據權利要求5所述的濾膜輔助分離生物樣本中糖蛋白全O-連接糖鏈的方法，其特征在于：步驟（2）中，除最后一次離心操作是在離心機中12,000g離心外，其他的離心操作均是在離心機中14,000g離心；所述振蕩混合均是在550rpm的恒溫振蕩孵育器中進行。

7.對按照權利要求1所述方法分離得到糖蛋白全O-連接糖鏈樣品進行鑒別的方法，包括以下步驟：

（1）糖鏈除鹽處理

準備Sepharose?4B：加Sepharose?4B至離心管中，再向該離心管中加入體積比為1:1的甲醇：水溶液，搖勻，離心，棄上清，重復清洗至少1次；再向離心管中加入體積比為5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，搖勻，離心，棄上清，重復清洗至少1次；

向糖蛋白全O-連接糖鏈樣品中加入體積比為5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液，上樣至Sepharose?4B的離心管中搖勻，25℃振蕩反應；14,000g離心15min棄上清；再加入5:1:1的正丁醇：甲醇：水溶液搖勻，12,000g離心5min，棄上清，重復清洗至少1次；再加入1:1的甲醇：水溶液搖勻，25℃振蕩，12,000g離心15min，收集上清，并冷凍干燥；

（2）分析樣品中的全O-連接糖鏈結構

取50%甲醇溶液完全溶解經步驟（3）處理后的糖蛋白全O-連接糖鏈樣品，點樣于MTP?Anchorchip?384點的靶板上，真空抽干；再加20mg/ml的基質DHB至樣品板上，真空抽干；以反射陽性離子模式鑒定多糖，一級質譜方法參數如下：離子源1，7.50KV；離子源2，6.75KV，反射電壓1，29.5KV；反射電壓2，13.95KV；LIFT1，19KV；LIFT2，3.7KV；激發光源為N₂激光，分子量檢測范圍為700-6800；檢測時每個樣品在多點采集圖譜，每個圖譜掃描1500次，最后將所有譜圖疊加得到最后的多糖一級圖譜；

（3）復雜糖鏈樣品的MALDI結果分析

采用SimGlycan?4軟件，選擇目標離子分析其一級圖譜，分析參數為：選擇前體離子分子量，電荷狀態，陽性離子化模式，加和Na⁺，離子容忍度為1，無化學衍生化，無還原端修飾；分析后得到可能的糖鏈結構，選擇其中得分最高即最可能的糖鏈結構，結果用Glycanworkbench并標注于圖中。