[發明專利]一種TBX5蛋白的表達方法

有效

• 申請號: 201210219310.3
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102703492A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 李曉紅;王建軍;李倩倩;余細勇
• 申請（專利權）人: 廣東省人民醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/47;C07K1/22
• 代理公司: 廣州市深研專利事務所 44229
• 代理人: 姜若天

技術領域

????本發明涉及生物技術及生物醫藥制品領域，具體地說，涉及一種

TBX5蛋白的表達方法。

背景技術

生物科技的迅猛發展，人們能利用DNA重組技術，將所需的編碼蛋白的DNA序列克隆到表達載體上，實現目的蛋白的大量表達。使用細菌或者真核細胞表達外源蛋白的可行性在生物技術領域有巨大潛力，近十年來，利用基因工程手段生產商業化的蛋白質需求急劇增加。

大腸埃希氏菌（E.coli）已經是世界上最廣泛使用的用于蛋白表達系統。由于大腸埃希氏菌的遺傳背景清楚，易于生長和控制，花費低廉，重組蛋白的表達效率高，因此長期以來,?大腸埃希氏菌是實驗室和工業水平生產蛋白的最廣泛的方法。目前有各種各樣的大腸埃希氏菌菌株及與之匹配的具各種特性的質?？晒┻x擇。如pET系列，pGEX系列等。

pET?系統是在E.coli中克隆和表達重組蛋白的最廣泛也最強大的系統。目的基因被克隆到pET質粒載體后，受噬菌體T7強轉錄及可選擇的翻譯信號控制，宿主細胞提供表達所需要的T7?RNA聚合酶。通過加入誘導劑IPTG誘導目的基因表達。表達載體除具有蛋白表達所需要的啟動子外，在終止子前有6個His編碼序列，便于蛋白的親和層析純化。外源蛋白在E.coli中的表達，可能以可溶形式存在，也可能以包涵體形式存在。尤其在高水平表達的條件下，更容易形成包涵體。對于可溶性蛋白和包涵體，均可用BugBuster等蛋白抽提試劑或超聲裂解的方法裂解菌體抽提蛋白。

近年來隨著生物技術的進步，特別是基因工程的突飛猛進，表達蛋白已經變得很容易，相對而言，純化卻是一個非常繁雜的工作，所以越來越多的研究者把需要表達的目標蛋白和親和純化用的標簽融合表達，這樣純化相對得比較容易，即使如此，由于蛋白的多樣性，純化依然是比較復雜而專業的工作，尤其對于不熟悉純化的研究者而言，它成為一個項目的瓶頸。蛋白純化的方法取決于多目的蛋白的屬性，細胞內形成的區域與形式，pET載體，宿主菌背景及表達蛋白的應用。通常純化蛋白使用的是親和層析的方法。親和層析是蛋白質或生物大分子與結合在介質上的配基特異結合，如采用結合有鎳的瓊脂糖在變性或非變性條件下對融合蛋白進行分離純化。鎳對6×His-tag蛋白具有特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有6個組氨酸親和標簽的蛋白。該系統在天然或變性條件下，對來源于各種表達系統（如桿狀病毒，哺乳細胞，酵母以及細菌）中的His標簽蛋白，均有很好的純化效果。

但在研究過程中，經常遇到蛋白保留在層析柱中難洗脫的現象，采用更強的洗脫條件如500mM咪唑，仍不能洗脫，直接用500mM咪唑加到6M鹽酸胍去洗脫，也有一大部分目的蛋白仍然吸附在親和柱上。所以，對于那些用這些常用方法難于洗脫的蛋白，找到一種能夠充分洗脫的方法具有重要意義。

TBX5基因于1997年在Holt-Oram綜合征（HOS）中被鑒別并克隆，是近年來發現的、在心臟發育過程中起重要作用的一個轉錄因子。人TBX5基因定位于12q24.1，屬于T-box轉錄因子家族，編碼518個氨基酸，在胚胎心臟和發育中的肢體組織中表達。TBX5基因在脊椎動物進化過程中高度保守。在心臟發育，尤其是房室腔初始分化過程中起著十分關鍵的作用。在心臟發育早期，TBX5在整個心臟均勻表達；當線性心管形成時，TBX5表達呈梯度方式，后部最強，向前漸弱；當心管環化時，TBX5表達不均勻的情況愈加明顯，只在未來左心室區域表達，在未來右心室和流出道區域不表達，直到心臟發育成熟，這種表達方式都保持不變。TBX5基因在早期心臟發育中的這種動態的表達方式對于心臟的正常發育，尤其是心房和左心室的正常發育是必須的。而TBX5基因表達受到精確調控，TBX5基因表達量過低或過高都將導致心臟和手畸形的發生。TBX5與另兩個轉錄因子NKX2.5、GATA4之間存在著復雜的相互作用，在心臟發育中起主要作用，共同調控許多下游基因的表達。尤其最近的研究發現，采用TBX5，GATA4和MEF2C這三個轉錄因子可以把成纖維細胞轉分化為心肌細胞，從而用于心臟再生醫學的治療與研究。但其具體的作用機制及作用途徑仍不清楚。因此，為了更透切地研究TBX5的基因功能，需要得到高濃度和高純度的TBX5蛋白。以往采用的蛋白表達系統所獲得的蛋白濃度低，不能滿足研究及以后臨床應用的需要，因此迫切需要建立一種高效表達及分離純化TBX5蛋白的方法。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高效簡便的生產高濃度、高純度野生型TBX5蛋白的新方法，尤其是涉及此蛋白的分離純化方法。