[發明專利]一種鹵代酸脫鹵酶的提取純化方法

有效

• 申請號: 201210218974.8
• 申請日: 2012-06-28
• 公開（公告）號: CN103509778A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 張錦友;薛松;曹旭鵬
• 申請（專利權）人: 中國科學院大連化學物理研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12P7/42;C12R1/38
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明設計鹵代酸脫鹵酶，具體地說是施氏假單胞菌（Pseudomonas?stutzeri）中的鹵代酸脫鹵酶的分離純化方法及其應用。

技術背景

鹵代有機化合物是精細化工，醫藥等重要的原料及中間體。脫鹵酶是一類能夠使鹵素從鹵代化合物中釋放出來的一類酶。它不僅在降解環境有機鹵化物中起到重要的作用，而且其立體選擇性催化活性在手性拆分及制備手性化合物上也具有良好的應用前景。

目前，已發現的產脫鹵酶的細菌絕大部分來自于陸生環境，來自于海洋環境的微生物則極少。海洋中含有豐富的鹵素離子，生活在高鹵素濃度環境中的海洋生物所產生的鹵素有機物也非常高，然而，菌種、氣候、海域環境等因素，都會造成酶的性質及活性差異。因而篩選新的鹵代酸脫鹵酶會對該酶的工業應用奠定良好的基礎。

發明內容

本發明的目的是提供鹵代酸脫鹵酶的分離提純的方法及用于外消旋的2-鹵代酸的手性轉化。

為實現上述目的，本發明技術方案如下：

鹵代酸脫鹵酶的分離提取方法，其以施氏假單胞菌（Pseudomonas?stutzeri）為原料，提取并分離純化得到兩種鹵代酸脫鹵酶，且兩種酶的立體選擇性相反。

具體操作過程如下，

1）收集的菌體，用10-100mM的磷酸鹽緩沖液（pH6-9）清洗后，超聲破碎細胞；

2）于0-10℃，3000~15000rpm離心10-60min，取上清；

3）上清液中加入硫酸銨制成20-40%的硫酸銨飽和度，攪拌1-2h后，離心取蛋白沉淀物，用pH4-10的磷酸鹽緩沖液分別重溶后，得到降解D-2-氯丙酸的鹵代酸脫鹵酶，進一步用超濾膜超濾除鹽，膜的截留分子量為10000Da。

4）在3）的基礎上所得的上清進一步加入硫酸制成60-100%的硫酸銨飽和度，攪拌1-2h后，離心去沉淀的蛋白，用pH4-10的磷酸鹽緩沖液重溶后，得到降解L-2-氯丙酸的鹵代酸脫鹵酶，最后用超濾膜超濾除鹽，膜的截留分子量為10kDa.

所述硫酸銨分級沉淀所得鹵代酸脫鹵酶還可以采用陰離子交換樹脂及瓊脂糖樹脂進一步純化，具體為：

1)所得兩種鹵代酸脫鹵酶分別經陰離子柱交換柱層析分離。用NaCl(0-1M)或Na₂SO₄（0-0.3M）進行線性梯度洗脫，得到活性組分。酶液體積與洗脫液體積比為1:20-40。收集活性組分并測定蛋白含量。

2)將離子交換柱所得活性組分經超濾濃縮后，上凝膠柱，用0.02-0.08M，pH4-9的磷酸鉀緩沖液洗脫分離，得到鹵代酸脫鹵酶。

所述陰離子交換樹脂為DEAE-Sepharose?FF，Q-Sepharose?FF，Q-Sepharose?XL或Q-sepharose?HP。瓊脂糖凝膠樹脂為Sephacryl?S200，Superdex?200或Sephadex?G100。

外消旋的2-鹵代酸的手性轉化方法的具體技術方案如下：1mL反應體系中含加入手性的5-50mM?2-鹵代酸，50-100mM緩沖液及脫鹵酶。在30℃反應0.5-24h后，加入1%（v/v）濃磷酸（85%,w/v）終止反應，得到轉化產物。

所述緩沖液為K₂HPO₄-K₂HPO₄（pH7.5）時，酶的加入量為：0.1-0.8mL；緩沖液為Glycine-NaOH(pH?10.0)時，酶的加入量為：0.05-0.1mL。

有益效果

本發明與現有技術相比，具有如下有益效果

1．從施氏假單胞菌中分離純化得到鹵代酸脫鹵酶。利用本技術，在施氏假單胞菌中首次分離純化得到2種具手性選擇性的鹵代酸脫鹵酶。

2．本發明作為一種具有選擇性降解鹵代酸的脫鹵酶具有良好的應用前景。本發明分離得到的鹵代酸脫鹵酶可將鹵代酸選擇性脫鹵，得到相應的手性羥基酸。

3．由于能夠降解鹵代酸，且對兩種手性的鹵代酸起作用，可應用于環境領域，消除鹵代酸對環境的危害。

具體實施方式