[發明專利]玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用

無效

• 申請號: 201210218745.6
• 申請日: 2012-06-29
• 公開（公告）號: CN102888402A
• 公開（公告）日: 2013-01-23
• 發明（設計）人: 杜何為;程水源;黃敏;李琳玲;許鋒;程華
• 申請（專利權）人: 黃岡師范學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，涉及一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用。

背景技術

我國每年受洪澇災害的農田面積平均為956萬公頃，其中嚴重的年份，受災面積達1500萬公頃以上。在亞洲地區，洪澇災害給玉米的生產造成了很大的損失，僅南亞，每年超過15％的玉米種植面積遭受不同程度的危害。在印度，洪澇災害造成玉米每年減產25-30％。我國南方春玉米和北方夏玉米在正常的栽培季節中，經常遭受洪澇和漬害，玉米根系長期處于低氧狀態，導致玉米減產10％-40％。澇漬害已成為我國南方玉米高產、穩產的主要制約因子之一。因此，克隆玉米淹水脅迫響應基因及其啟動子，對闡明玉米淹水脅迫響應形成的分子機理以及玉米和其他旱生作物耐澇漬的遺傳改良，具有十分重要的理論價值和實踐意義。

ERF基因是參與植物非生物脅迫響應的關鍵基因之一，是水稻、深水稻和擬南芥淹水脅迫響應的關鍵基因。因此，克隆玉米ERF基因的啟動子，有助于闡明玉米耐漬性形成的分子機制，同時為玉米及其他旱生作物的耐漬遺傳改良提供理論指導。然而，玉米ERF啟動子的克隆，目前，尚未見有報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種綿玉米淹水脅迫響應zmERF2基因啟動子的克隆及其應用，含有1個ARE、1個GARE、1個GC?motif、2個Skn-1motif、1個CGTCA-motif和1個MBS位點順式元件，這些順式元件與植物激素、厭氧脅迫響應相關；是一個組織特異型的啟動子，只在根系中表達；是一個誘導型的啟動子，受淹水誘導高效表達。該啟動子與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，在淹水、澇漬條件下，可提高轉基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆境能力。同時該啟動子只在根部表達，不涉及食用轉基因植物地上部分的食品安全問題。zmERF2啟動子在旱生植物的耐漬遺傳改良中，具有很好的應用前景。

其技術方案如下：

1、玉米zmERF2基因的獲得

根據已知的玉米基因組信息，使用煙草ERF2蛋白的AP2/ERF結構域高度保守的蛋白質序列，進行同源比對分析，電子克隆出121個ERF基因。通過與擬南芥、水稻、煙草等其他植物ERF基因的比較分析，剔除48個假陽性，獲得了73個ERF基因，分別命名為zmERF1--zmERF73。玉米自交系Hz32的耐漬性較強，而Mo17耐漬性較弱，在玉米3葉1心期，分別對Hz32和Mo17進行0、4、12h的淹水處理，并利用real-time?PCR對73個ERF基因在各處理根系的表達進行了分析，結果發現zmERF2基因在Hz32根系受淹水誘導高效表達，而在Mo17中表達量低，結果暗示zmERF2基因的啟動子是淹水脅迫響應的誘導型啟動子。

2、玉米自交系Hz32葉片總DNA的提取

取玉米葉片5.0g于液氮中研磨，轉入50ml離心管中。加預熱至95℃的CTAB緩沖液(1.17MNaCL、0.0016M?EDTA-8.0，0.835M?Ttis-7.5，1.6％CTAB，1％β-疏基乙醇)10ml，混勻。在65℃水浴鍋內反應90分鐘，不時輕搖離心管。取出離心管，待冷至室溫后，加入等體積氯仿∶異醇(24∶1)，小心搖動試管10分鐘。8000rpm離心10分鐘，將上清轉至另一50ml離心管中。加2/3體積異丙醇，小心混勻，將棉絮狀DNA轉入盛10ml70％乙醇的50ml離心管中，浸泡12小時。倒掉70％乙醇，將DNA晾干，加入1ml?TE溶解。待DNA完全溶解后，轉入2.0ml離心管中，加入10μl10mg/ml?RNaseA，混勻；在37℃下，溫育2小時。再用1ml苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次，8000rpm離心10分鐘。將上清液轉入2.0ml離心管中，加入1/10體積的3M?NaAC(PH5.2)，2/3體積異丙醇沉淀DNA。將棉絮狀DNA轉入2.0ml離心管中，用70％乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁，倒去70％乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml?T.E溶液，完全溶解DNA，于-20℃長期保存。

3、zmERF2基因啟動子的克隆