[發明專利]TCR Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201210214549.1
• 申請日: 2012-06-27
• 公開（公告）號: CN102816782A
• 公開（公告）日: 2012-12-12
• 發明（設計）人: 李揚秋;查顯豐;陳少華;楊力建;吳秀麗;李萡
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/66;C12N5/10;C12R1/91
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 裘暉;陳燕嫻

1.一種TCRVα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒，其特征在于：將如SEQ?ID?No.1所示的TCRVα13:ζ基因和如SEQ?ID?No.2所示的TCRVβ21:ζ基因分別構建于pIRES質粒中IRES序列兩側的多克隆位點中得到TCRVα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒。

2.根據權利要求1所述的TCR?Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒，其特征在于：所述的多克隆位點由多克隆位點A和多克隆位點B組成。

3.根據權利要求1所述的TCRVα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒，其特征在于：將如SEQ?ID?No.1所示的TCR?Vα13:ζ基因構建于pIRES質粒中的多克隆位點A和將如SEQ?ID?No.2所示的TCRVβ21:ζ基因構建于pIRES質粒中的多克隆位點B得到TCRVα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒。

4.權利要求1所述的TCR?Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒的構建方法，其特征在于包括如下步驟：

（1）TCRζ基因的獲得：根據TCRζ基因序列設計引物，利用帶有XhoⅠ酶切位點的上游引物ζF：5'-GCCTCGAGGATCCCAAACTCTGCTACC-3'和帶有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點的下游引物ζR為：5'-ATGTCGACGAATTCT?TAGCGAGGGGGCAGGG-3'；以健康人基因組為模板，PCR擴增得到TCRζ基因；

（2）TCRζ-IRES2-EGFP重組質粒的構建：將XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的TCRζ基因和XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的真核表達載體pIRES2-EGFP連接，得到TCRζ-IRES2-EGFP重組質粒；

（3）Vα13:ζ-IRES-EGFP和Vβ21:ζ-IRES-EGFP基因真核載體構建：

①擴增TCR?Vα13基因的引物為帶有NheⅠ酶切位點序列的上游引物αF：5’-TCGGCTAGCGGAGCAAGAAGGCAAAGCATC-3’和帶有XhoⅠ酶切位點的下游引物αR：5’-CGGCTCGAGATCACAGGAACT-TTCTGGGC-3'；擴增TCRVβ21基因引物為帶有NheⅠ酶切位點的上游引物βF：5’-TAAGCTAGCCTCCCATCCTTCCCTGACCCT-3'和帶有XhoⅠ酶切位點下游引物βR：5’-AATCTCGAGGCCACAGTCTGCTCTACCC?CA-3'；以CML患者外周血單個細胞的cDNA為模板，PCR擴增得到TCR?Vα13和TCR?Vβ21亞家族基因PCR產物，其中，TCRVα13基因的序列如上所示，TCRVβ21基因的序列如上所示；

②利用NheⅠ和XhoⅠ限制性內切酶雙酶切步驟①得到的TCR?Vα13基因、TCR?Vβ21基因以及步驟（2）得到的TCRζ-IRES2-EGFP重組質粒；將雙酶切后的TCR?Vα13基因與雙酶切后的TCRζ-IRES2-EGFP連接，將雙酶切后的TCR?Vβ21基因與雙酶切后的TCRζ-IRES2-EGFP連接，得到TCR?Vα13:ζ-IRES-EGFP和TCR?Vβ21:ζ-IRES-EGFP基因真核載體；

（4）TCR?Vα13:ζ-IRES真核載體構建：利用NheⅠ和EcoRⅠ內切酶雙酶切TCRVα13:ζ-IRES-EGFP和pIRES質粒，取雙酶切后的TCRVα13:ζ基因片段與雙酶切后的pIRES連接，得到TCR?Vα13:ζ-IRES質粒；

（5）TCR?Vα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ真核載體構建

①以步驟（3）制備的TCRVβ21:ζ-IRES-EGFP基因真核載體為模板，利用含XbaⅠ酶切位點的上游引物F1：5’-TTGTCTAGACTCCCATCCTTC?CCTGACCCT-3'和含SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點的下游引物R1：5’-ATGTC?GACGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGG-3'進行PCR擴增，得到Vβ21:ζ基因PCR產物；

②利用XbaⅠ和SalⅠ限制性內切酶雙酶切Vβ21:ζ基因PCR產物和步驟（4）制備的TCRVα13:ζ-IRES質粒，將雙酶切后的Vβ21:ζ基因PCR產物與TCRVα13:ζ-IRES連接，得到TCRVα13:ζ-IRES-Vβ21:ζ重組質粒。