[發明專利]一種生產體細胞克隆牛囊胚的方法

在審

• 申請號: 201210211817.4
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102766655A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 杜衛華;朱化彬
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/877
• 分類號: C12N15/877
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;姜義民

技術領域

本發明涉及一種生產體細胞克隆牛囊胚的方法。

背景技術

哺乳動物體細胞克隆是指將體細胞核移入去核受體細胞（成熟卵母細胞或受精卵）中，新的重構胚按供體的遺傳信息重新進行編程、分裂、分化和發育。目前較為流行的體細胞核移植方法是手工克隆法和顯微操作法。

克隆技術本身的效率受各個環節的影響，包括卵母細胞的去核、體細胞注入卵母細胞、去核卵母細胞與體細胞的融合、重構胚的激活、重構胚的體外培養。

在克隆過程中成熟卵母細胞去核是核移植技術中的一個重要環節,要求去得完全，又盡可能地減少對細胞質的損傷。手工克隆法去核采用切割法，其對細胞損傷大，死亡率較高；顯微注射法則將操作針刺入卵母細胞質中，對細胞骨架和膜的破壞性較強，而且去核時吸走的、包含染色體的細胞質一般占卵母細胞總體積的四分之一左右，造成卵母細胞質的大量丟失。另外，還有熒光引導去核法、盲吸法等。熒光引導去核法，由于使用熒光照射對卵母細胞有一定的損害，有報道稱〔Critser等，1986〕，在熒光照射下照射時間不能超過20秒，否則發育能力下降或喪失。盲吸法是指用McGrath和Solter的方法〔McGrath等，1983〕，即從靠近卵母細胞排放第一極體的部位將細胞膜內的核物質和部分細胞質一起吸出。因為除小鼠和兔以外，其它大動物的成熟卵母細胞中期板在顯微鏡下無法看到，所以去核就是盲目的。由于顆粒細胞的干擾或第一極體退化或卵子老化，使得染色體位置與第一極體偏離，所以盲吸法去核并不完全成功。

融合是動物克隆技術過程中另一個重要環節，常用方法是電刺激。電融合的原理就是利用高壓電場在卵細胞膜和供核細胞膜上同時擊出一些微孔，這樣緊貼在一起的卵細胞膜和供核細胞膜就通過這些微孔發生融合，最終將供核引入去核卵細胞質內。顯微注射法中融合率低，平均為70-80%，融合的失敗導致胚胎的丟失和克隆效率的降低。

體細胞克隆技術在多個品種的家畜中都獲得成功，時至今日全世界已有數千頭體細胞克隆牛誕生。盡管如此,牛的體細胞克隆效率仍然很低，因此，從體細胞克隆的關鍵環節入手，開發一種高效率的體細胞克隆牛囊胚的生產方法具有重大的意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題為提供一種高效率的生產體細胞克隆牛囊胚的方法。

本發明所提供的生產體細胞克隆牛囊胚的方法，包括以下步驟：

(1)以牛耳緣成纖維細胞為核移植供體細胞；

(2)將牛卵母細胞進行體外成熟培養，將體外培養成熟并排出第一極體的卵母細胞作為核移植受體細胞；

(3)將步驟(2)所得卵母細胞擠壓去核并去除透明帶；

(4)先將一枚步驟(3)所得卵母細胞與一枚供體細胞用PHA法黏附形成復合體，施以交流電，再將另一枚步驟(3)所得卵母細胞黏附在上述復合體上，使其排列順序為卵母細胞-供體細胞-卵母細胞；最后施以直流電對其進行融合，構建重構胚胎；

(5)所述重構胚胎激活后，進行體外培養得克隆囊胚。

上述生產方法中，所述牛耳緣成纖維細胞的代齡為5-15代，在核移植前經過血清饑餓處理或不經過血清饑餓處理。

所述牛卵母細胞是由直徑為2-8mm的牛卵泡中采集的、由完整致密的卵丘細胞包裹的卵母細胞。

上述方法中，步驟(2)所述體外成熟培養的培養基的制備方法為，在TCM199培養基中添加體積百分比為10%的FBS，0.01IU/ml的FSH，0.01IU/ml的LH和1μg/ml的E2。

步驟(3)所述擠壓去核是在顯微鏡下用拔尖的去核針挑破第一極體處的透明帶，并將第一極體及其下方的胞質擠除；所述去透明帶是用鏈酶蛋白酶消化去除。

步驟(4)所述電融合與步驟(5)所述重構胚胎激活的間隔時間為1-3h，優選間隔時間為2h。

發明人比較了電融合與激活的時間間隔分別為1h、2h和3h的無透明帶克隆牛胚胎的卵裂率和囊胚率，結果如表1所示。所述卵裂率的計算公式為：卵裂率=重構胚卵裂數/融合后重構胚數；所述囊胚率的計算公式為：囊胚率=囊胚數/卵裂胚胎數。下同。

表1、電融合與重構胚激活的時間間隔對卵裂率和囊胚率的影響