[發明專利]一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法

有效

• 申請號: 201210210815.3
• 申請日: 2012-06-25
• 公開（公告）號: CN102912010A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 彭海;張靜;周俊飛
• 申請（專利權）人: 海南廣陵高科實業有限公司;江漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 徐立

技術領域

本發明屬于遺傳學領域，公開了一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法。

背景技術

種子純度是農業生產中最重要的問題之一，它關系到國家糧食安全，是種子產業化開發中最重要、最核心的內容，因而也關系種子企業生死存亡。大部分農作物種子純度要求都在95%以上，甚至為99.9%（表1），因而，需要大量統計抽樣才能獲得準確數據，工作量十分巨大。例如合格的雜交稻品種純度要求達到96%，則意味著100個植株最多只允許4個雜株，那么要使檢測結果可靠，至少應該檢測500粒種子，工作量是巨大的。另外，由于技術缺陷，各種種子純度檢測方法還存在受環境影響、速度慢、費用高等問題，影響到了鑒定的準確性、種子及時上市、成本等重要問題。

表1農作物種子純度標準（GB4404.1-2008）

種子純度檢測經歷了從田間表型鑒定到實驗室分子標記鑒定的發展。田間表型鑒定的操作過程是這樣的：從生產的種子中隨機抽取一定數量的種子，田間種植并觀察性狀，通過與品種的真實性狀比較，鑒定出雜株。例如，由100個植株構成的鑒定群體中，發現2株株高和3株顏色明顯不同于該品種真實性狀的植株，則該品種的純度為（2+3）/100=95%。田間鑒定的缺陷是明顯的：一是需要種植一個季節，周期長、占地多、費用高，而種子從生產到銷售的時間只有2-3個月時間，田間鑒定周期嚴重影響了種子銷售上市。二是植株性狀常受環境影響，如在高肥力條件下，植株更高大，從而誤判為雜株，使鑒定結果不準確。分子標記鑒定種子純度在很大程度上克服了以上問題，其理論依據可以簡單描述為：利用雜株與品種間特定分子的不同，鑒定雜株，計算種子純度。依據分子標記的類型不同，可分為蛋白質（如同工酶等）和DNA分子標記鑒定。蛋白質分子標記鑒定也有明顯的缺陷，一是蛋白表達同樣受環境影響，使鑒定結果不準確；二是可用于鑒定的蛋白分子標記不多，使這種技術難以用于區分親緣關系較近的品種。DNA分子標記是根據雜株與正常品種在DNA水平上的序列差異進行鑒定的，該技術在很大程度上克服了以上幾種鑒定方法的不足。首先，DNA序列差異不再依賴于環境，因此，鑒定結果是準確的；第二，從理論上講，任何雜株與正常品種DNA都存在差異，因此，可用于鑒定任意品種；第三，由于種子、幼苗、成株期的DNA都是一樣的，因此，鑒定不再需要田間種子，只需要室內簡單發芽提取DNA即可，縮短了檢測周期，為種子推廣贏得了時間。然而，企業可能需要檢測多個生產地點或生產者的種子是否合格，檢測工作量巨大，即使是利用DNA分子標記檢測，常常也會由于工作量大而無法及時完成檢測，同時，巨大的工作量也伴隨著檢測成本過高的問題。例如，國家法律規定，雜交水稻種子的純度不得低于96%，因此，若要求在95%的概率保證下，種子純度誤差不超過1%，則每個樣本需要抽檢3000粒種子才能達到要求，若檢測100個樣本，則需要提取DNA、PCR、電泳分別為3000*100=30萬次。在檢測人員和設備有限的情況下，幾乎是不可能在在種子包裝與銷售前完成檢測工作，嚴重影響上市。在此情況下，只能減少抽樣量，以達到減少工作量的目的。例如，一般企業抽檢100粒種子，在此情況下，若依舊要求純度誤差不過1%，那么對結果的把握度（概率保證）僅為15%左右。所以，即使得到了檢測結果，并沒有把握判斷該批次的種子是否合格，給市場銷售帶來巨大風險。

發明內容

本發明實施例的目的是針對上述現有技術的缺陷，提供了一種能夠準確、快速檢測雜交種子純度的方法。

為了實現上述目的本發明采取的技術方案是：

一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟：根據種子純度要求，計算抽樣樣本量；等量抽樣并混合提取DNA或分別提取DNA后再等量混合；按檢測位點的堿基序列，設計PCR引物擴增檢測位點；回收并純化PCR擴增產物；利用擴增產物建庫并進行高通量測序；根據檢測位點序列比例，計算種子純度。

本發明提供更優選的技術方案是：一種快速、準確的檢測雜交水稻種子純度的方法，包括以下步驟：

（1）計算最小抽樣樣本量：根據商品種子純度要求、設定的概率保障和允許的誤差，確定最小的樣本抽樣量；

（2）DNA提取：對每一植株，選取相同部位的等量材料混合后提取DNA；或者，提取每一植株的DNA，再對DNA進行定量抽取后再等量混合；