[發(fā)明專利]一種質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210210385.5
• 申請(qǐng)日: 2012-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN102766653A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳宏;李密杰;劉棟;藍(lán)賢勇;雷初朝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/861
• 分類號(hào): C12N15/861;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A，其特征在于：所述質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A含有如SEQ?ID?NO.1所示核苷酸序列的秦川牛PPARGC1A基因。

2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A，其特征在于：所述質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A是由秦川牛PPARGC1A基因通過AdEasyTM系統(tǒng)構(gòu)建所得。

3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A，其特征在于：所述質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A中的PPARGC1A基因連接于穿梭質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子之下。

4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A，其特征在于：所述質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A中的PPARGC1A基因起始密碼子前含有Kozak序列。

5.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A，其特征在于PPARGC1A基因終止密碼子前含有6個(gè)His標(biāo)簽序列。

6.構(gòu)建權(quán)利要求1～5中任一權(quán)利要求所述質(zhì)粒型腺病毒載體pAd-PPARGC1A的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)、RT-PCR擴(kuò)增PPARGC1A后與pGM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.eoli?DH5α感受態(tài)細(xì)菌，得到pGM-T-PPARGC1A重組質(zhì)粒；

(2)、pGM-T-PPARGC1A重組質(zhì)粒和pAdTrack-CMV穿梭質(zhì)粒分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal?I和Not?I雙酶切，將PPARGC1A基因片段和pAdTrack-CMV載體片段利用T4DNALigase進(jìn)行酶連反應(yīng)，酶連產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli?DH5α感受態(tài)細(xì)菌，得到pAdTrack-CMV-PPARGC1A重組穿梭質(zhì)粒；

(3)、限制性內(nèi)切酶Pme?I線性化pAdTrack-CMV-PPARGC1A重組穿梭質(zhì)粒，用線性化pAdTrack-CMV-PPARGC1A重組穿梭質(zhì)粒轉(zhuǎn)化含有pAdEasy-1質(zhì)粒E.coli?BJ5183感受態(tài)細(xì)菌，利用E.coli?BJ5183內(nèi)源Cre重組酶的高效同源重組系統(tǒng)，在細(xì)菌中完成pAdTrack-CMV-PPARGC1A和pAdEasy-1的同源重組，獲得同源重組成功的重組腺病毒質(zhì)粒pAd-PPARGC1A。