[發明專利]一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法

有效

• 申請號: 201210208891.0
• 申請日: 2012-06-25
• 公開（公告）號: CN102757995A
• 公開（公告）日: 2012-10-31
• 發明（設計）人: 蔡俊;王常高;顏作文;胡瑛;林建國
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12P23/00
• 分類號: C12P23/00;C12R1/645
• 代理公司: 武漢帥丞知識產權代理有限公司 42220
• 代理人: 朱必武

技術領域

????本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法。?

背景技術

β-?胡蘿卜素不僅是VA原，具有預防眼疾、保護視力的功能，而且還具有抑制細胞變異，抗癌、防癌、抗氧自由基、增強機體抵抗力、維護人體上皮組織正常的生理功能，以及促進兒童生長發育、美容等一系列重要作用，在世界許多國家被廣泛用作食品營養強化劑及添加劑。

目前β-?胡蘿卜素的制備方法主要包括以下幾種：（1）天然β-胡蘿卜素的提取。工業生產中常從胡蘿卜、玉米、沙棘等富含?β-胡蘿卜素的植物中提取?β-胡蘿卜素。（2）β-胡蘿卜素的化學合成。采用有機化工原料，通過化學反應合成?β-胡蘿卜素。3、生物合成法。采用微生物發酵法生產胡蘿卜素，從品質、技術、資源和成本等因素考慮均優于化學合成法。國內外微生物合成?β-胡蘿卜素的研究主要集中在絲狀真菌（三孢布拉氏霉菌）和紅酵母方面。除此之外，也有杜氏鹽藻提取法、螺旋藻提取法以及基因工程法用于β-胡蘿卜素的生產研究。

利用三孢布拉氏霉菌發酵制備的β-胡蘿卜素是順反式β-胡蘿卜素混合物，且利用三孢布拉氏霉菌發酵制備的β-胡蘿卜素的培養基原料為天然物質，無毒無害。而人工合成的β-胡蘿卜素幾乎全為反式異構體，比如中國專利CN101088989A公開了一種利用C22二炔多烯化合物為原料，與格氏試劑反應生成雙格氏化合物，所得的雙格氏化合物與2，2，6-三甲基環幾酮反應得到雙去氧β-胡蘿卜素，其還原反應得到反式β-胡蘿卜素。還有中國專利CN101081829A公開了一種由維生素A衍生物與三苯基膦反應得到的有機膦鹽，在氧化劑存在下，進行偶聯反應得到反式β-胡蘿卜素。又如中國專利CN1291608A公開了用砜的衍生物生產β-胡蘿卜素的方法。另外，中國專利CN1215723A公開了一種利用維俤希反應制備類胡蘿卜素的方法。中國專利CN1090271A公開了一種β-胡蘿卜素的化學合成方法，其包括三個步驟，由維生素醋酸酯經氫氧化鈉水溶液水解的到VA，在用氧化劑氧化VA得到維生素A醛，最后通過二價鈦偶聯維生素A醛而制得反式β-胡蘿卜素。

在生物合成β-胡蘿卜素法方面，中國專利CN101008000A公開了一種利用粘性紅圓酵母生產β-胡蘿卜素的方法，包括將粘性紅圓酵母活化、發酵培養一定時間離心得到菌體，采用酸熱法破碎菌體細胞，然后加入石油醚：丙酮（1:1）的混合液，28℃震蕩1h一般可得389ug/g。但在使用該方法制備β-胡蘿卜素得率太低。另外，中國專利CN1193048A公開了一種利用孢子接種在氣升發酵罐中培養絲狀真菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法，該工藝包括一級種子培養和二級種子培養及發酵等工藝，然而發酵培養基中植物油添加量較大，從而造成成本過高。

發明內容

鑒于現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種利用微生物生產β-胡蘿卜素的方法。利用本發明的方法可以獲得成本低、得率高且天然優質的β-胡蘿卜素產品。

為了實現本發明，發明人通過大量試驗反復研究，并終于獲得了如下制備β-胡蘿卜素的方法：

一種利用三孢布拉氏霉菌發酵制備β-胡蘿卜素的方法，包括如下步驟：?

（1）菌種活化：在無菌環境下將三孢布拉霉正負菌株分別接種到斜面PDA培養基中，置于培養箱內，28℃培養4d，待三孢布拉霉正負菌株分別長出孢子后，在無菌條件下，用無菌生理鹽水將斜面培養基中孢子刮洗下來，并配制成均勻的孢子懸液，使正負菌孢子懸液的濃度分別達到：正菌10³個孢子/mL，負菌10⁴個孢子/mL；

（2）種子培養：將正負菌分別以孢子懸液的方式接種到種子培養基中，種子培養基裝在250mL的三角瓶中，裝液量?50mL，培養溫度為28℃，轉速200?r/min，正菌培養時間為20h，負菌培養時間為24小時，得到三孢布拉霉正負菌株種子液；

（3）發酵培養：將達到對數生長期的正負菌種子液按1:5的比例在無菌的條件下混合，再以1%-10%的接種量接入發酵培養基中培養144-168h；所述發酵培養基的配制方法為：取40.8克麩皮，加入1000mL自來水，煮沸1h，雙層紗布過濾，濾液定容到1000mL得到麩皮浸出液；取100mL麩皮浸出液，加入麥芽糖7.16克、硫酸鎂0.04克，大豆粉1克，KH₂PO_4?0.2克，大豆油1克，V_B10.001克，即得；