[發(fā)明專利]一種檢測Leber病調(diào)控子的試劑盒及用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210207655.7
• 申請日: 2012-06-24
• 公開（公告）號: CN102747152A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 管敏鑫;冀延春;蔣萍萍;張娟娟;肖云
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 33200
• 代理人: 張法高;趙杭麗

1.一種檢測Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，由引物序列、提取樣本基因組DNA的試劑、PCR擴增反應(yīng)試劑、陽性標本對照、陰性標本對照以及使用說明書構(gòu)成；其中，提取樣本基因組DNA的試劑由細胞裂解液和主要成分是蛋白酶K的溶液Ⅰ組成；PCR擴增反應(yīng)試劑包括dNTP、10×PCR緩沖液、MgCl₂、三蒸Taq水和酶；引物序列是：外前向引物F:?TGG?CTC?CTT?TAA?CCT?CTC?CA，外反向引物R:?AAG?GAT?TAT?GGA?TGC?GGT?TG；內(nèi)前向引物F:?CCT?ACC?ACT?CAC?CCT?AGC?AT，內(nèi)反向引物R:?AAT?CAG?TGC?GAG?CTT?AGC?GC；限制性內(nèi)切酶包括限制性內(nèi)切酶NlaⅢ；陽性標本對照是含有線粒體序列第4435位點發(fā)生A>G突變的酶切樣本、陰性標本對照是不含有線粒體序列第4435位點發(fā)生A>G突變的酶切樣本。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒，其特征在于，在上述試劑盒中，在PCR擴增反應(yīng)試劑中添加0.1-0.2μl二甲基亞砜。

3.權(quán)利要求1所述的一種檢測Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體DNA突變的試劑盒在檢測與Leber病調(diào)控子相關(guān)的線粒體基因mtDNA?A4435G突變中的應(yīng)用。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實現(xiàn)：

（1）基因組DNA的提取：運用蛋白酶K消化裂解法，從少量的血液標本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液的樣本中提取基因組DNA；

（2）特異性PCR擴增：使用Primer?5.0軟件和Oligo7.0軟件根據(jù)SEQ?ID?NO:5所示的人類線粒體基因序列設(shè)計引物包含突變位點的基因片段3777-4679，外前向引物F:?TGG?CTC?CTT?TAA?CCT?CTC?CA，外反向引物R:?AAG?GAT?TAT?GGA?TGC?GGT?TG；內(nèi)前向引物F:?CCT?ACC?ACT?CAC?CCT?AGC?AT，內(nèi)反向引物R:?AAT?CAG?TGC?GAG?CTT?AGC?GC；?

（3）酶切鑒定：將上述PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NlaⅢ對A4435G突變位點處進行酶切；?

（4）突變檢測：瓊脂糖凝膠電泳檢測，直接根據(jù)酶切PCR產(chǎn)物產(chǎn)生的DNA片段數(shù)量及DNA片段大小，檢測mtDNA是否發(fā)生A4435G突變。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟（1）中，樣本來源于從毛細血管靜脈血標本、帶毛囊的毛發(fā)、口腔粘膜刮片、血濾紙片或唾液，根據(jù)取樣方式或被測樣本形式不同，對不同樣本進行預(yù)處理，樣本預(yù)處理方法如下：

（1）血標本或血濾紙片：取20～200μl血標本或1cm²的血濾紙片放入1.5ml?Eppendorf管，加入900μl紅細胞裂解緩沖液室溫靜置10min，充分裂解紅細胞，12000rpm離心1min，收集白細胞沉淀；所用緩沖液為20mmol/L?Tris-HCl，pH?7.6；

（2）帶毛囊的毛發(fā)：用70%乙醇洗帶毛囊的毛發(fā)1?次，后再用蒸餾水沖洗毛發(fā)2次，在1.5ml?Eppendorf管中分別放入2～4?根毛發(fā)，毛囊置于Eppendorf管底部，用干凈的剪刀剪去毛發(fā)高于Eppendorf管的部分；

（3）口腔粘膜刮片或唾液：收集唾液前，必須讓被收集者漱口，以除去口腔中過多的老化細胞、食物殘渣、牙膏、咖啡、煙，半小時內(nèi)不喝水、進食、吸煙，然后開始收集口腔粘膜刮片或唾液，選擇如下方法收集唾液樣本：①舌頭圍繞口腔刮取粘膜細胞，將0.1ml唾液直接吐進Eppendorf管內(nèi)；②生理鹽水漱口，吐進Eppendorf管內(nèi)，吸取PBS溶液至裝有通過上述任一種方法收集的唾液樣本的Eppendorf管中，反復(fù)吹打后，12000rpm離心5min，除去上清，重復(fù)該過程一次；③用棉拭子反復(fù)刮拭面頰內(nèi)壁6次，空氣中干燥，然后用滅菌過的鑷子小心撕去其外表面，放入Eppendorf管中；④將唾液吐在濾紙上，空氣中干燥后形成唾液斑，再用干凈的剪刀剪成1cm²碎紙片置于Eppendorf管中。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，在步驟（1）中經(jīng)過預(yù)處理后，用細胞裂解液和蛋白酶K對上述樣本進行消化裂解，再鹽析法去除蛋白等雜質(zhì)，異丙醇沉淀DNA，最后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后于-20℃保存?zhèn)溆谩?!-- SIPO -->