[發明專利]一種雙功能探針及其制備方法與在檢測G-四鏈體結構中的應用

有效

• 申請號: 201210207279.1
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102719238A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 黃志紓;古練權;譚嘉恒;顏金武;葉文杰
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C09K11/06
• 分類號: C09K11/06;C09K9/02;C07D487/04;G01N21/31;G01N21/64;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛;郝文婷

技術領域

本發明涉及一種新型雙功能探針及其制備方法，以及其在檢測G-四鏈體核酸二級結構的用途。

背景技術

G-四鏈體（G-quadruplex）是一種特殊的DNA二級結構。人類基因組中很多富鳥嘌呤區域具有形成這一結構的能力，包括端粒末端鳥嘌呤重復序列，以及多種基因的啟動子區域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰島素基因等。最新研究表明，很多非編碼區的RNA序列也可以形成G-四鏈體結構，RNA的G-四鏈體結構比DNA更穩定，該結構可能通過阻止基因的翻譯或參與蛋白結合識別的過程而達到抑制腫瘤生長的效果。G-四鏈體結構的形成對于體內的一系列生理過程都存在調控作用。研究證明，某些啟動子區域的G-四鏈體結構會顯著影響基因的轉錄和翻譯水平，因此G-四鏈體結構被認為是起到分子開關的功能，其形成和拆散可能涉及到信號傳導、細胞凋亡和細胞增殖等一系列體內重要的生理過程。所以，在體內或者體外試驗中，能夠特異性地檢測出G-四鏈體結構的存在或者形成，對于研究G-四鏈體結構的相關生物學功能以及開發以G-四鏈體結構為靶點的抗癌藥物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在體內和體外檢測G-四鏈體結構的研究都取得了一些進展。由于體內大大過量的雙螺旋DNA的存在，以及復雜的細胞內環境，使得體內的檢測相對于體外檢測需要解決更多的難題，目前已有一些熒光分子可以實現體內G-四鏈體結構的檢測。而目前體外實驗中檢測G-四鏈體結構主要是通過儀器的手段，比如圓二色譜法、核磁共振、表面等離子共振、熒光共振能量轉移等方法，這些方法對儀器和技術操作的要求都較高，而且價格較昂貴，基本上不能普及使用。

近年來，香豆素母體被廣泛應用于生物、醫藥、香料、化妝品及熒光染料等領域。其苯并吡喃結構具有Stokes位移大、熒光量子產率高、以及光穩定性好等優點，使香豆素類結構成為熒光傳感器分子設計中的優秀候選熒光團。而申請人實驗室前期的工作中合成了一系列的Isaindigotone類的化合物，其對G-四鏈體具有較好的選擇性和結合能力。申請人將香豆素結構融合到Isaindigotone結構當中，利用分子內電荷轉移的機理，得到了新型的G-四鏈體探針。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種雙功能探針。

本發明的另一個目的在于提供上述探針的制備方法。

本發明的再一個目的在于提供上述探針在檢測G-四鏈體結構的應用。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

本發明提供了一種雙功能探針，其結構式為：

式中R₁、R₂為H、F、Cl、Br或I；

A^-為陰離子，可以是碘離子，對甲苯磺酸離子，三氟甲磺酸離子等。

優選地，所述的A^-為N原子甲基化反應后的陰離子。

本發明同時提供了上述探針的制備方法，表示如下：

具體步驟為：先用4-二乙胺基水楊醛與丙二酸二乙酯反應，得到化合物，再將在POCl₃的存在下與DMF反應，得到醛基香豆素中間體；再將2-吡咯烷酮與不同取代基的鄰氨基苯甲酸混合，在三氯氧磷的存在下，關環反應得到化合物，將與甲基化試劑反應，甲基化后得到化合物，將與醛基香豆素中間體反應，得到最終探針化合物。

本發明還提供了上述探針在檢測G-四鏈體結構中的應用。

優選地，在上述應用中，通過如下方法檢測G-四鏈體結構：

1）將待測DNA溶于PH值7.2-7.4的緩沖液，得到溶液A；將該探針溶解，再用PH值7.2-7.4的緩沖液稀釋，得到溶液B；

2）將溶液A和溶液B混合，使混合液中待測DNA與探針的摩爾比為1~3，混合后對混合液進行紫外可見光譜分析或熒光光譜分析，也可以在日光下或者在紫外燈下進行肉眼觀察，判斷待測DNA是否為G-四鏈體結構；判斷方法如下：

（a）在日光下進行肉眼觀察時，與溶液B對比，若混合液在日光下有明顯的顏色變化，由紅色變為藍紫色，即可判斷待測DNA為G-四鏈體結構；若混合液的顏色與溶液B的顏色一樣或者只有非常微弱的變化，既可以判斷待測DNA為非G-四鏈體結構；