[發明專利]血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒及其制備方法

無效

• 申請號: 201210206882.8
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102692514A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 曾驥孟;鄭立謀;萬巍巍;蔡良良;呂曉楠;葉輝銘
• 申請（專利權）人: 廈門大學
• 主分類號: G01N33/82
• 分類號: G01N33/82;G01N33/574
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

1.血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于包括：

不同濃度的校準品：含25-羥基維生素D3的人血清；

包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板：孔內包被抗-25羥基維生素D3的抗體；

標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3；

質控品：含25-羥基維生素D3和疊氮化鈉的人血清凍干品，所述疊氮化鈉的百分含量為0.07%～0.09%；

底物顯色液：包括底物A和底物B，所述底物A為四甲基聯苯胺與醋酸鈉混合溶液，所述底物B為過氧化氫的水溶液；

反應終止液：采用0.35～0.5M的氫氯酸；

沖洗液：采用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為0.1%。

2.如權利要求1所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于所述25-羥基維生素D3濃度采用0nmol/L，6nmol/L，18nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，180nmol/L，330nmol/L。

3.如權利要求1所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒，其特征在于所述酶標板采用12×8條，包裝到帶干燥劑的錫箔袋中。

4.如權利要求1所述的血液25-羥基維生素D3腺癌檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）配制不同濃度的校準品：含25-羥基維生素D3的人血清，25-羥基維生素D3濃度分別為，0nmol/L，6nmol/L，18nmol/L，30nmol/L，50nmol/L，180nmol/L，330nmol/L；

2）制備包被有25-羥基維生素D3的抗體的酶標板，具體方法如下：

（1）用0.05M?pH9.0的碳酸鹽包被緩沖液將抗-25羥基維生素D3的抗體稀釋至含量為1～10μg／ml的混合液；

（2）在每個96孔酶標板的反應孔中加0.1ml抗-25羥基維生素D3的抗體混合液，4℃過夜；

（3）次日，棄去孔內溶液，用含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖水溶洗3次，每次3min；

3）制備標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，具體方法如下：

（1）稱取5mg辣根過氧化物酶溶解于1ml蒸餾水中，再加入0.2ml?0.1M高碘酸鈉水溶液，得混合溶液；

（2）將混合溶液裝入透析袋中，對1mM?pH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，取出醛基化辣根過氧化酶溶液，再加入20μl?0.2M?pH9.5碳酸鹽緩沖水溶液，調節pH值至9.0～9.5，然后加入10mg?25-羥基維生素D3半琥珀酸酯在1ml?0.01M碳酸鹽緩沖水溶液中；

（3）加入0.1ml?4mg/ml硼氫化鈉水溶液，混勻，再置4℃2h后裝入透析袋中，對0.15MpH7.4磷酸鹽緩沖水溶液透析，4℃過夜后，加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1h，再3000rpm離心0.5h，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨水溶液洗，最后沉淀物溶于2.5ml?0.15M?pH7.4的磷酸鹽緩沖水溶液中；

（4）將步驟（3）得到的溶液裝入透析袋中，用磷酸鹽緩沖液透析，去除銨離子后，10,000rpm離心30min去除沉淀，上清液即為標有辣根過氧化物酶的25-羥基維生素D3，分裝后，冰凍保存；

4）配制質控品：將25-羥基維生素D3溶解到人血清，冷凍干燥后，稱重。為便于長期儲存，按照0.07%～0.09%百分含量加入疊氮化鈉；

5）配制底物A：稱取TMB?17.2mg，加DMSO?1ml溶解，然后加入醋酸鈉緩沖液66ml；

6）配制底物B：取一水合檸檬酸2.1g、無水磷酸氫二鈉2.82g和0.75%的過氧化氫尿素0.64ml，用雙蒸水定容至100ml，pH4.5～5.0；

7）配制反應終止液（反應終止液記為STOP）：取0.5M的氫氯酸水溶液；

8）配制沖洗液：取含有吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，所述吐溫-20的百分含量為0.1%。