[發明專利]酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201210206854.6
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102732626A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 周贊虎;張海艷;蔡開珍;李可;鄭俊超
• 申請（專利權）人: 周贊虎
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所 35200
• 代理人: 馬應森

技術領域

本發明涉及生物檢測試劑盒，尤其是涉及一種采用環介導等溫擴增技術的酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

酸土環脂芽孢桿菌（Alicyclobacillus?acidoterrestris）是一種嗜熱、嗜酸、好氧的桿菌，是耐熱菌（thermo-acidophilic?bacteria，TAB）中污染果汁的主要菌種，其芽孢能經受酸性果汁加工中的巴氏殺菌而存活，在適宜的溫度下可大量繁殖，引起果汁感官品質劣變，耐熱菌超標是濃縮果汁產品最為嚴重的質量問題之一（胡貽椿，岳出利，袁亞宏等.果汁中脂環酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus?spp．）的危害及其控制[J]．食品科學，2008，29(1)：364-368）。近年來，我國濃縮蘋果汁行業取得了突飛猛進的進步，2010年我國已經成為世界蘋果濃縮汁的生產出口第一大國。2011年1～11月我國出口濃縮蘋果汁數量為54.13萬噸，金額為9.36億美元（http://www.21food.cn/html/news/35/666252.htm（食品商務網））。目前，國際貿易中對果汁中耐熱菌有嚴格要求，是蘋果濃縮汁的必檢項目，也是當前中國蘋果濃縮汁出口中所遭遇的主要技術壁壘之一和蘋果濃縮汁生產中急待解決的問題。目前，檢測酸土環脂芽孢桿菌的方法主要有傳統的微生物生理生化檢測法和分子生物學的PCR法（孔德義，董佳，白小瓊.脂環酸芽孢桿菌的研究進展[J]．糧食與食品工業，2011，18（2）：39-42），尚未見到用環介導等溫擴增擴增技術檢測酸土環脂芽孢桿菌的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速、特異性強且成本低的酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒。

本發明的另一目的是提供一種檢測酸土環脂芽孢桿菌的方法。

所述酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒包括：

1）環介導等溫擴增反應液；

所述環介導等溫擴增反應液含有10×Thermopol反應緩沖液、10mmol/L?dNTP、50mmol/L硫酸鎂、20μmol/L酸土環脂芽孢桿菌上游內引物、20μmol/L酸土環脂芽孢桿菌下游內引物、20μmol/L酸土環脂芽孢桿菌上游外引物、20μmol/L酸土環脂芽孢桿菌下游外引物；

酸土環脂芽孢桿菌上游外引物F3：

CGGGTAGGCATCTACTTGTG；

酸土環脂芽孢桿菌下游外引物B3：

GCGGAAGATTCCCTACTGC；

酸土環脂芽孢桿菌上游內引物FIP：

GCCGTTACCTCACCAACTAGCTGAAAGATGCAACTGCATCGC；

酸土環脂芽孢桿菌下游內引物BIP：

GATGCGTAGCCGACCTGAGAGTGCCTCCCGTAGGAGTCT；

2）Bst?DNA聚合酶：含8個活性單位（U）/μl；

3）顯色劑：SYBR?GREEN?I熒光染料，1000×；

所述檢測酸土環脂芽孢桿菌的方法，使用所述酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒，所述方法包括以下步驟：

1）細菌DNA的提取：

2）環介導等溫擴增；

3）顯色檢測。

本發明的主要原理是利用4條特殊設計的引物及具有鏈置換活性的Bst?DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地擴增DNA，在1h內能達到10⁹靶序列拷貝，可通過熒光染料來觀察擴增效果。

本發明的優點如下：

本發明采用環介導等溫擴增（Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）技術建立了酸土環脂芽孢桿菌的環介導等溫擴增檢測試劑盒和檢測方法，此技術特異性強，與PCR方法有相同的靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀或熒光定量PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，且結果不必用凝膠電泳方法來檢驗，加入熒光染料目測觀察即可，不用凝膠成像系統，簡單快速，特別適合于基層食品檢測機構和食品加工企業自檢。

采用環介導等溫擴增（Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP）方法檢測酸土環脂芽孢桿菌，為食品安全監控提供新的科學依據。

具體實施方式

下列實施例是進一步對本發明的說明，不應當作對本發明的限制。

實施例1、制備酸土環脂芽孢桿菌檢測試劑盒：

（1）環介導等溫擴增反應液：