[發(fā)明專利]一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210205601.7
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN102776189A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏蘭琴;王暉;張岷
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/21;A01N57/16;A01N63/00;A01P7/04
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用。?

背景技術(shù)

麥蚜（尤其是麥長管蚜）是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年小麥蚜蟲危害面積可高達(dá)0.17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15%—30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)50%。桃蚜是廣食性害蟲，寄主約有350多種，主要危害煙草、桃、李、梅、梨等果樹和白菜、蘿卜、辣椒、菠菜等蔬菜，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥和蔬菜抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。?

植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點(diǎn)之一，通過寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲危害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過程是雙鏈RNA（dsRNA）進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成21-23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過植物介導(dǎo)的昆蟲腸道特異基因RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問題，目前已完成生產(chǎn)性試驗(yàn)。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗(yàn)表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時(shí)幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能；Zha等從褐飛虱中腸中克隆了3個(gè)高度表達(dá)的基因：NlHT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水平下降了40%到70%，并且在水稻的篩管部發(fā)現(xiàn)了dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002（主要在唾液腺中表達(dá)）和Rack-1（主要在腸道中表達(dá)）2個(gè)基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-1的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲?的產(chǎn)仔數(shù)目減少。?

小麥和蔬菜抗蚜蟲種質(zhì)資源缺乏，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過基因工程育種提高小麥和蔬菜抗蚜特性。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供了一種dsRNA。?

本發(fā)明提供的dsRNA，為如下1）或2）：?

1）由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；?

2）由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。?

上述dsRNA的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述編碼基因具體為如下1）或2）：1）為序列表中序列1所示的核苷酸；2）為序列表中序列2所示的核苷酸。?

上述dsRNA或上述的編碼基因在防治蚜蟲和/或制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。?

上述應(yīng)用中，所述防治蚜蟲體現(xiàn)在促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長。?

上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長；所述導(dǎo)入具體為飼喂；?

所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜；?

所述促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長具體通過抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。?

上述dsRNA或上述的編碼基因在促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。?

上述dsRNA或上述的編碼基因在抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。?

含有上述dsRNA或上述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。?