[發明專利]一種鑒定油葵康地6和7號品種純度的方法

無效

• 申請號: 201210205099.X
• 申請日: 2012-06-21
• 公開（公告）號: CN102690892A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 王沛政;段維;楊勇剛;李新鵬
• 申請（專利權）人: 新疆康地種業科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種鑒定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特征在于，具體鑒定方法步驟如下：

（1）油葵DNA提取：取培養2周的油葵幼嫩真葉于研缽中,加入液氮迅速研磨使成均勻粉狀,在樣品未融化之前加入65℃預熱的CTAB提取液500μl,充分混勻后把樣液移入1.5?ml離心管中,置65℃水浴50?min,其間顛倒離心管數次；取出樣品冷卻至室溫,分別加入等體積的酚/氯仿和氯仿/異戊醇進行抽提,其中，酚/氯仿按體積比1：1計，氯仿/異戊醇按24∶1計，經4℃12?000?r/min離心5?min；取上清液加入0.6倍體積的異丙醇混勻,于室溫放置5-10?min,?12?000?r/min離心5?min,去上清,用100μl?70%乙醇洗滌沉淀,置無菌臺吹干；用雙蒸水溶解DNA沉淀,4℃保存備用；CTAB提取液為：50?mmol/L?Tris-HCl?pH8,?0.7?mmol/L?NaCl,10?mmol/L?EDTA,?pH8,?1%?CTAB,?20?mmol/L?2-巰基乙醇；

（2）PCR擴增反應及程序：反應總體積為20ul,?其中含10×反應緩沖液，1.25mmol/L?MgCl₂,?1u?Taq?DNA?聚合酶，0.1mmol/L?dNTPs,?1umol/L?Primer引物OPB05,?1-5ng模板DNA；擴增程序為94℃?預變性4min;?94℃?變性20sec,?37℃?退火?50sec,?72℃?延伸?1min20sec,?40個循環后再于72℃?延伸10min；

（3）膠板的制備：待0.5%瓊脂糖膠溶液冷卻至50℃左右時，加入最終濃度為0.5微克/毫升的EB，搖勻，輕輕倒入電泳制膠板上，除掉氣泡；待凝膠冷卻凝固后，垂直輕拔梳子；將凝膠放入電泳槽內，加入1x電泳緩沖液，電泳緩沖液50×TAE?Buffer?配制方法：?稱量Tris?242g，Na₂EDTA·2H₂O?37.2g?溶于1L燒杯中，使電泳緩沖液液面剛高出瓊脂糖凝膠面；

（4）電泳、觀察和拍照：取4ml上述步驟(2)PCR擴增反應液加樣緩沖液1ml，加樣緩沖液為：0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青，40克蔗糖定容至100ml；加樣后的凝膠板立即通電進行電泳，當溴酚藍移動到距離膠板下沿約1cm處時，停止電泳；電泳完畢，取出凝膠；在波長為254nm的紫外燈下觀察染色后的電泳膠板；DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，于凝膠成像系統中拍照并保存之；

（5）上述步驟以商品油葵品種康地6和7號及其雙親的DNA為模板，進行大量隨機引物分子標記的篩選和重復，獲得了鑒定出能夠同時區分父本、母本和雜交種的隨機引物標記OPB05，該引物序列TGCTCCCTTC。

2.如權利要求1所述的鑒定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特征在于，所述的引物OPB05擴增的康地6號產生的母本特異標記OPB05條帶大小為310bp，產生的父本特異標記OPB05條帶大小為325bp；雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶。

3.如權利要求1所述的鑒定油葵康地6和7號品種純度的方法，其特征在于，所述的引物OPB05擴增的康地7號產生的母本特異標記OPB05條帶大小為450bp，產生的父本特異標記OPB05條帶大小為880bp；雜交種的DNA片段中包含父母本的特征譜帶。