[發(fā)明專利]檢測嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒及其抗體的間接ELISA試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201210204910.2
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102721812A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設計）人: 陸吉虎;高峰;唐應華;楊維維;侯繼波
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業(yè)科學院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙) 32238
• 代理人: 張立榮

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及抗體工程技術，具體涉及檢測嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒及其抗體的間接ELISA試劑盒。

背景技術

雞傳染性支氣管炎（Avian?Infectious?Bronchitis,?IB）是由冠狀病毒屬的傳染性支氣管炎病毒（Infectious?Bronchitis?Virus,?IBV）引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，以引起雞呼吸道感染、腎炎、產蛋下降為主要特征，可引起幼雞死亡率高達40%，成年雞感染后產蛋量下降10%-50%，給世界養(yǎng)雞業(yè)帶來重大的經(jīng)濟損失。

雞傳染性支氣管炎病毒具有多種血清型和多組織嗜性，自1931年最早報道呼吸型IB以來，隨后報道了腎型、腸型、生殖道型、腺胃型等傳染性支氣管炎，至今已經(jīng)報道的血清型達30余種，近年來新的血清型和變異株仍不斷出現(xiàn)，給流行病學的研究和防疫帶來了極大地困難，也給養(yǎng)雞業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。我國的免疫雞群和非免疫雞群均易發(fā)生嗜腎型IBV的感染，其中已經(jīng)報道的有嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株、HF2株等。嗜腎型雞傳染性支氣管炎的控制關鍵之一在于建立快速診斷的方法。分離病毒是診斷本病最經(jīng)典可靠的方法，但是用時較長，而且常因同時感染的其他病毒影響而漏檢；瓊脂擴散試驗(AGP)操作簡單，但是靈敏度低，沉淀抗體持續(xù)時間較短，不適合疫苗免疫效果的評價；病毒中和試驗(VNT)可以用于檢測IB的抗原和抗體，敏感、特異，并可用于病毒的分型，但是實驗操作復雜，費時而且昂貴；微量血凝抑制（HI）實驗操作簡單、快速，易于推廣，具有早期診斷的價值，但是雞傳染性支氣管炎病毒無自然血凝活性，必須經(jīng)過特殊處理才可以凝集紅細胞，這也限制了HI在IBV抗體檢測中的應用；RT-PCR檢測方法具有敏感、快速、特異等特點，但是對實驗室條件要求高，操作復雜，難以推廣。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，該試劑盒含有高特異性的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株單克隆抗體，能夠準確、安全、快速、靈敏地檢測雞傳染性支氣管炎病毒抗體。

本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒的間接ELISA試劑盒，該試劑盒含有高特異性的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株單克隆抗體，能夠準確、安全、快速、靈敏地檢測雞傳染性支氣管炎病毒。

本發(fā)明提供一種檢測嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒抗體的間接ELISA試劑盒，該試劑盒包括：已包被有抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒?DS10株單克隆抗體、并結合了嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株滅活純化抗原的酶標板。?

采用如下方法制備所述酶標板：

（a）向酶標板的每孔中分別加入100μL濃度為0.59～9.44?μg/mL的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒DS10株單克隆抗體溶液，4℃包被過夜；

（b）洗滌；

（c）用牛血清白蛋白溶液封閉，洗滌；

（d）向酶標板的每孔中分別加入100?μL濃度為104.2～208.4μg/mL的嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒?DS10株滅活純化抗原溶液，37℃孵育1.5?h，洗滌。

步驟（a）中所述加入到酶標板每孔中的抗嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒?DS10株單克隆抗體溶液的濃度為2.36?μg/mL。

步驟（d）中所述加入到酶標板每孔中的嗜腎型雞傳染性支氣管炎病毒?DS10株滅活純化抗原溶液的濃度為138.90?μg/mL。

該試劑盒還包括：

（1）10×洗滌液：pH7.4，體積100?mL；所述10×洗滌液是含有質量濃度分別為5%?Tween-20、8%氯化鈉、0.2%氯化鉀、2.9%磷酸氫二鈉和0.2%磷酸二氫鉀的水溶液；

（2）10×血清稀釋液：pH7.4，體積100?mL；所述10×血清稀釋液是含有質量濃度分別為5%牛血清白蛋白、5%?Tween-20、8%氯化鈉、0.2%氯化鉀、2.9%磷酸氫二鈉和0.2%磷酸二氫鉀的水溶液；

????（3）酶標試劑：辣根過氧化物酶標記的兔抗雞IgG，25?mL；

（4）底物顯色液，包括：

A液：將1?mL濃度為10?mg/mL的3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺溶液加入到100?mL?濃度為0.1?mol/L、pH為6.0的磷酸緩沖液中配成；所述濃度為0.1?mol/L、pH為6.0的磷酸緩沖液的配制方法為：0.1?mol/L磷酸二氫鈉水溶液87.7?mL和0.1?mol/L磷酸氫二鈉水溶液12.3?mL混合即成；