[發明專利]特異促進肝細胞CYP1A2基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 201210204776.6
• 申請日: 2012-06-20
• 公開（公告）號: CN102766654A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發明（設計）人: 徐新云;毛侃瑯;袁建輝;毛吉炎
• 申請（專利權）人: 深圳市疾病預防控制中心
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;A61K48/00;A61P43/00
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產權事務所 44248
• 代理人: 胡吉科

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，尤其涉及特異促進肝細胞CYP1A2基因高表達的慢病毒表達載體及其構建方法與應用。?

背景技術

細胞色素P450酶(Cytochrome?P450，CYP450)是一類重要的混合功能氧化酶系統，主要分布在生物體的內質網上和線粒體中，參與許多內源性和外源性物質的生物轉化過程。CYP1A2屬于CYP450家族中的CYP1A亞族，由CYP1A2基因編碼，主要存在于肝臟中，約占肝臟CYP酶總量的13％，僅次于CYP3A和CYP2C亞家族，居肝臟各CYP酶含量的第三位。CYP1A2在腸道、腦、肺等組織中也有少量分布。CYP1A2參與咖啡因、華法林、茶堿、普萘洛爾、美西律、維拉帕米、硝苯地平、他克林等20多種藥物的代謝過程，同時也負責一些內源性激素的羥化反應。此外，CYP1A2在一些前致癌物和前毒性物質的體內活化過程中也起重要作用。?

現有技術中，阮昊將CYP1A2基因cDNA片段連接到了pFastBac載體上，并將其包裝成桿狀病毒后感染sf9細胞，得到了能表達CYP1A2基因的sf9細胞，該細胞能夠用于體外研究藥物代謝，但因不是人源細胞不適用于外源物質對人毒理的相關研究。現有技術中尚無可在人源細胞中持續、穩定且高效表達CYP1A2基因的載體。?

發明內容

為解決現有技術中存在的問題，發明人在載體的選擇、重組構建方法等方面進行了大量的探索研究，預料不到地發現，將包含Xho?I酶切位點和Xma?I酶切位點的CYP1A2基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表達載體的多克隆位點中可成功構建特異促進人源肝細胞CYP1A2基因高表達的慢病毒表達載體，從而完成本發明。?

本發明提供一種特異促進肝細胞CYP1A2基因高表達的慢病毒表達載體，包括pLVX-AcGFP-C1表達載體的基本序列、抗性基因序列、多克隆位點序列、啟動子序列和CYP1A2基因cDNA序列；所述多克隆位點包括Xho?I酶切位點和Xma?I酶切位點，所述CYP1A2基因cDNA序列包括Xho?I酶切位點、CYP1A2基因編碼序列和Xma?I酶切位點，所述CYP1A2基因cDNA序列正向插入所述多克隆位點序列中。?

采用上述技術方案，本發明提供的CYP1A2基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1?表達載體構建得到的慢病毒表達載體具有轉染效率高，用量少，可持續、高效、穩定地提高CYP1A2基因表達的優點，可作為有力工具應用于制備治療CYP1A2基因表達異常相關疾病藥物的研究和開發中。?

作為本發明的進一步改進，所述CYP1A2基因編碼序列通過PCR擴增獲得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列為：5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’(SEQ?ID?NO：1)，所述下游引物的序列為：5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’(SEQ?ID?NO：2)。采用上述PCR引物序列，通過PCR可以擴增出CYP1A2基因編碼序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表達載體中持續表達CYP1A2基因，減少了序列合成費用，成本較低。?

相應的，本發明還提供特異促進肝細胞CYP1A2基因高表達的慢病毒表達載體的構建方法，包括如下步驟：?

A)CYP1A2基因引物設計：根據CYP1A2基因的CDS序列，使用Oligo?7分析后選取5’-CCGCTCGAGATGGCATTGTCCCAGTCTGTTC-3’(SEQ?ID?NO：1)作為上游引物，選取5’-ACCCGGGTCAGTTGATGGAGAAGCGCAGC-3’(SEQ?ID?NO：2)作為下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物無引物二聚體，且退火溫度差距較小；?