[發(fā)明專利]食品調(diào)味品中罌粟成分的檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210202246.8
• 申請(qǐng)日: 2012-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN103484530A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高宏偉;孫敏;林超;劉彩霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物源成分的檢測(cè)技術(shù)，具體地說是用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食品調(diào)味品中罌粟成分的檢測(cè)方法。?

背景技術(shù)

罌粟(Papaver?somniferumL)是罌粟科的二年生草本植物。原產(chǎn)小亞細(xì)亞、印度和伊朗。我國(guó)部分地區(qū)藥物種植場(chǎng)有少量栽培。?

罌粟殼含少量嗎啡(Morphine)、可待因(Codeine)、蒂巴因(Thebaine)、那可汀(Narcotine)、罌粟殼堿(Narcotoline)和罌粟堿(Papaverine)；另含多糖約2.4％，水解可得乳糖10％、阿拉伯糖6％、木糖6％、鼠李糖4％、乳糖醛酸(Galacturonic?acid)60％、4-0-甲基葡萄糖醛酸(4-0-Methylglucuronic?acid)4％、微量巖藻糖(Fucose)、2-0-甲基巖藻糖(2-0-Methylfucose)、2-0-甲基木糖(2-0-Methylxylose)及葡萄糖醛酸(G-tucuronic?acid)、景天庚糖(Sedoheptulose)、D-甘露庚酮糖(D-Mannoheptulose)、D-甘油基-D-甘露辛酮糖(D-Glycero-D-Mannooctulose)、內(nèi)消旋肌醇(Mesoinositol)、赤蘚醇(Erythritol)。食品中加入罌粟味道鮮美，但過量食用后易致癮。?

本發(fā)明經(jīng)過對(duì)罌粟和常見食品成分進(jìn)行PCR檢測(cè)驗(yàn)證，適合檢驗(yàn)檢疫對(duì)罌粟成分鑒定，引物對(duì)罌粟具有滿意的特異性和靈敏性，具操作簡(jiǎn)單，成本低的特點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明屬于植物源成分的檢測(cè)技術(shù)，具體地說是用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測(cè)食品調(diào)味品中罌粟成分檢測(cè)方法，為檢測(cè)罌粟成分提供有效工具，從而加強(qiáng)對(duì)食品安全問題的監(jiān)督監(jiān)管，保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。?

本發(fā)明的主要原理為：針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)一組引物(上游引物：CODM?F：5’-gctaaactcacgcttgcagaaa-3’和下游引物：CODM?R：5’-gttacagacgcaccaatattattcaac-3’)。進(jìn)行核酸檢測(cè)時(shí)，模板DNA經(jīng)加熱至94-95℃一定時(shí)間后，DNA雙鏈解離，即變性成單鏈。當(dāng)溫度下降到退火溫度時(shí)，兩條單鏈重新配對(duì)，即復(fù)性。PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，變性狀態(tài)下呈單鏈，熒光染料不與其結(jié)合就沒有熒光信號(hào)。當(dāng)溫度為退火溫度時(shí)，PCR產(chǎn)物復(fù)性成為雙鏈DNA，熒光染料與其結(jié)合，可以檢測(cè)到強(qiáng)的熒光信號(hào)。在雙鏈DNA最多時(shí)，熒光信號(hào)最高，即出現(xiàn)吸收峰，也就是在退火溫度下出現(xiàn)最高的吸收峰。?

本發(fā)明涉及的食品調(diào)味品中罌粟成分的檢測(cè)方法，其中的試劑包括如下：?

(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液A?

包括1×PCR?Master?Mix(內(nèi)含熱啟動(dòng)的Taq?DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25μL?SYBR?Green熒光染料；?

上游引物CODM?F：5’-gctaaactcacgcttgcagaaa-3’；下游引物CODM?R：5’-gttacagacgcaccaatattattcaac-3’?

其中上游引物、下游引物：1∶1；?

其中dNTP內(nèi)的四種脫氧核糖核酸的混合物的質(zhì)量比為dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。?

(2)陽性對(duì)照DNA?

上面所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液A，每管24μL的最佳組成為：1×PCR?MasterMix(內(nèi)含熱啟動(dòng)的Taq?DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP)，400nmol/L上下游引物，1.25μL?SYBR?Green熒光染料。?

使用上述試劑盒檢測(cè)食品調(diào)味品中罌粟成分的方法，依次包括下列步驟(1)-(3)：?

(1)待檢樣品DNA的提取?

DNA提取可使用CTAB法。?

(2)食品調(diào)味品中罌粟成分的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增?

A.在裝有24μL?PCR擴(kuò)增反應(yīng)液A的反應(yīng)管中加入1μL待檢樣品DNA，混勻。?

B.將PCR反應(yīng)管放入熒光PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增：?

95℃15min，1個(gè)循環(huán)預(yù)變性；?

95℃15sec，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。?

(3)應(yīng)用熒光定量PCR儀隨機(jī)軟件，測(cè)定熔點(diǎn)曲線。?

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。?

實(shí)施例1?

按下述方法檢測(cè)從中藥店購(gòu)得的罌粟殼，使用玉米粉作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照：?