[發明專利]轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因檢測用的引物和探針

無效

• 申請號: 201210202238.3
• 申請日: 2012-06-13
• 公開（公告）號: CN103484529A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 高宏偉;王述柏;孫敏;周茜
• 申請（專利權）人: 山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;青島農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于植物源成分的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測轉基因植物產品的磷酸甘露糖異構酶基因的檢測用的引物和探針。?

背景技術

甘露糖陽性選擇系統屬于非抗生素篩選系統之一，它是利用大腸桿菌的磷酸甘露糖異構酶基因(PMI)作為選擇基因，甘露糖作為選擇劑進行轉基因植物的篩選。甘露糖經由植物內源己糖激酶催化磷酸化為6-磷酸甘露糖，反應消耗ATP和磷酸鹽，會導致細胞分裂、生長缺少能量，并且6-磷酸甘露糖的過量積累對植物細胞有毒害作用。整合有外源PMI基因的轉化細胞能將6-磷酸甘露糖異構酶為6-磷酸果糖，使得代謝可繼續進行，避免了因6-磷酸甘露糖的大量積累，并產生ATP，為細胞的正常代謝提供了能量。非轉化細胞因缺乏磷酸甘露糖異構酶，不能利用6-磷酸甘露糖正常生長。因此，在含有甘露糖的培養基上，只有轉化細胞能正常生長，而非轉化細胞則被淘汰。該選擇系統在玉米轉基因過程中運用廣泛。?

在享有轉基因技術帶來的巨大實惠的同時，轉基因產品潛在的生態安全、食品安全問題也日益引起人們的關注，各國紛紛制定相應的法律法規對轉基因產品進行監管。除美國、加拿大、阿根廷和中國香港特區實行自愿標識制度外，國際上大多數國家如歐盟各國、匈牙利、瑞士、波蘭、日本、韓國等均制定了強制性標識制度。我國于2001年、2002年頒布實施《農業轉基因生物安全管理條例》及《農業轉基因生物標識管理辦法》，啟動了農業轉基因生物的監督監管機制。我國政府規定，凡是列入標識管理目錄并用于銷售的農業轉基因作物，應當加以標識，未標識和不按規定標識的，不得進口和銷售，因此，必須對轉基因產品進行有效的檢測。?

目前，國內還沒有轉基因植物中磷酸甘露糖異構酶基因PCR檢測試劑盒，本發明可彌補上述缺陷，采用實時熒光PCR的檢測方法完成轉基因植物中磷酸甘露糖異構酶基因的檢測。?

發明內容

本發明屬于轉基因植物產品的檢測技術，具體地說是用實時熒光PCR技術檢測轉基因植物產品的磷酸甘露糖異構酶基因的檢測用檢測方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些產品檢測中的局限性，為轉基因產品檢測提供有效工具，從而加強轉基因產品的監督監管，確保產品標簽的一致性，保護消費者的知情權和選擇權。?

本發明的主要原理為：針對保守序列設計一組引物(上游引物：PMI-taqF?5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’和?下游引物：PMI-TAQR?5’-gccgtggcctttgacagt-3’)和一條TAQMAN探針(PMI-TAQP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA)。進行核酸檢測時，模板DNA經加熱至94-95℃一定時間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman探針與模板特異性集合。Taqman探針的5端標記有報告集團，3端有非熒光淬滅集團。當探針完整的時候，報告集團所發射的熒光能被淬滅集團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結合的探針時，其3’→5’外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告集團原理淬滅集團，其能量不能被吸收，即產生熒光信號。隨著PCR循環的增加，目的片段成指數增長，熒光信號也同步增強，熒光信號的強弱直接反映模板數量。?

本發明涉及的轉基因植物產品中磷酸甘露糖異構酶基因的檢測方法，其中的試劑包括如下：?

(1)PCR擴增反應液A?

包括10×PCR反應緩沖液、0.1-0.4mmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、1-2U?Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、0.2-0.6μmol/L?Taqman探針；?

其中10×PCR反應緩沖液含有100mmol/L?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通X100；?

上游引物PMI-taqF：5’-ccgggtgaatcagcgttta-3’；下游引物PMI-taqR：5’-gccgtggcctttgacagt-3’；?

Taqman探針PMI-taqP：FAM-tgccgccaacgaatcaccgg-TAMARA?

其中上游引物、下游引物、Taqman探針的體積比為：1∶1∶0.6；?

其中dNTP內的四種脫氧核糖核酸的混合物的質量比為dTTP∶dATP∶dGTP∶dCTP＝1∶1∶1∶1。?

(2)陽性對照DNA?