[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因檢測用的檢測方法和試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210202227.5
• 申請(qǐng)日: 2012-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN103484528A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王述柏;高宏偉;周茜;孫敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué);山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測技術(shù)，具體地說是用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測用檢測方法和試劑盒。?

背景技術(shù)

在發(fā)展中國家，人口增長和食物短缺的矛盾日益尖銳，同時(shí)伴隨著耕地減少、生物種植和生存環(huán)境的惡化，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是解決這些問題的最有效途徑，轉(zhuǎn)基因技術(shù)不僅極大地提高了作物育種的效率，育成了一些具有突出特點(diǎn)的新品種，而且轉(zhuǎn)基因作物無論是在產(chǎn)量、品質(zhì)還是抗逆能力等方面都有顯著的優(yōu)勢，更突出的是轉(zhuǎn)基因技術(shù)可極大地降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的成本，緩解不斷惡化的農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境。自1983年第一例轉(zhuǎn)基因植株問世以來，世界已在35個(gè)科120多個(gè)種中獲得了轉(zhuǎn)基因植株，主要集中在大豆、玉米、油菜、棉花、馬鈴薯、西瓜、西葫蘆和木瓜上。?

在享有轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來的巨大實(shí)惠的同時(shí)，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品潛在的生態(tài)安全、食品安全問題也日益引起人們的關(guān)注，各國紛紛制定相應(yīng)的法律法規(guī)對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行監(jiān)管。除美國、加拿大、阿根廷和中國香港特區(qū)實(shí)行自愿標(biāo)識(shí)制度外，國際上大多數(shù)國家如歐盟各國、匈牙利、瑞士、波蘭、日本、韓國等均制定了強(qiáng)制性標(biāo)識(shí)制度。我國于2001年、2002年頒布實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》及《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，啟動(dòng)了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)督監(jiān)管機(jī)制。我國政府規(guī)定，凡是列入標(biāo)識(shí)管理目錄并用于銷售的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因作物，應(yīng)當(dāng)加以標(biāo)識(shí)，未標(biāo)識(shí)和不按規(guī)定標(biāo)識(shí)的，不得進(jìn)口和銷售，因此，必須對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行有效的檢測。?

目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測，主要采用蛋白檢測和DNA檢測的方法。兩類方法，對(duì)于不同產(chǎn)品中轉(zhuǎn)基因成分的檢出和定量檢測，各有優(yōu)、缺點(diǎn)。以DNA為測試對(duì)象的方法與以蛋白為測試對(duì)象的方法相比，在產(chǎn)品成分復(fù)雜的情況下，目標(biāo)DNA可以有效提取，受產(chǎn)品機(jī)制的影響較小；此外，DNA比較穩(wěn)定，不像蛋白質(zhì)組成那樣易受加工工藝的影響。Te9基因?yàn)閬碓从谕愣苟姿岷送囚然富虻慕K止子，可作為轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的篩選基因，利用熒光PCR技術(shù)檢測具有靈敏、特異的優(yōu)點(diǎn)。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的檢測技術(shù)，具體地說是用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測用方法，以克服基于蛋白的檢測方法在某些產(chǎn)品檢測中的局限性，為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測提供有效工具，從而加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的監(jiān)督監(jiān)管，確保產(chǎn)品標(biāo)簽的一致性，保護(hù)消費(fèi)者的知情權(quán)和選擇權(quán)。?

本發(fā)明的主要原理為：針對(duì)保守序列設(shè)計(jì)一組引物(上游引物：Te9-F：5’-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3；下游引物Te9-R：5’-ggttttcgctatcgaactgtga-3’；Taqman-MGB探針Te9-MGBP：FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。)。進(jìn)行核算檢測時(shí)，模板DNA經(jīng)加熱至94-95℃一定時(shí)間后，DNA雙鏈解離，引物及Taqman-MGB探針與模板特異性集合。MGB探針的5端標(biāo)記有報(bào)告集團(tuán)，3端由非熒光淬滅集團(tuán)，同時(shí)還連接有MGB修飾集團(tuán)(MinorGroove?Binder)。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告集團(tuán)所發(fā)射的熒光能被淬滅集團(tuán)吸收，儀器檢測不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中，遇到與模板結(jié)合的探針時(shí)，其3’→5’外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告集團(tuán)原理淬滅集團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)。隨著PCR循環(huán)的增加，目的片段成指數(shù)增長，熒光信號(hào)也同步增強(qiáng)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱直接反映模板數(shù)量。?

本發(fā)明涉及的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中Te9基因的檢測方法，其中的試劑包括如下：?

(1)PCR擴(kuò)增反應(yīng)液A?

包括10×PCR反應(yīng)緩沖液、0.1-0.4mmol/L?dNTP、2-4mmol/L硫酸鎂、1-2U?Taq酶、0.2-0.6μmol/L上游引物、0.2-0.6μmol/L下游引物、0.2-0.6μmol/L?Taqman-MGB探針；?

其中10×PCR反應(yīng)緩沖液含有100mmol/L?pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、500mmol/L氯化鉀和1％曲拉通X-100；?

上游引物Te9-F：5’-tttgagaatgaacaaaaggaccatat-3’；下游引物Te9-R：5’-ggttttcgctatcgaactgtga-3’；Taqman-MGB探針Te9-MGBP：FAM-attcattaactcttctccatcc-MGB。?

其中上游引物、下游引物、Taqman-MGB探針的體積比為：1∶1∶1；?