[發明專利]酶法制備谷胱甘肽的方法

有效

• 申請號: 201210201691.2
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN102978267A
• 公開（公告）日: 2013-03-20
• 發明（設計）人: 劉珊珊;秦永發
• 申請（專利權）人: 北京天開易達生物科技有限公司
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02
• 代理公司: 北京嘉予銘知識產權代理有限責任公司 11407
• 代理人: 崔建麗;彭曉云

技術領域

本發明涉及制備谷胱甘肽的方法，尤其涉及一種酶法制備谷胱甘肽的方法。

背景技術

谷胱甘肽廣泛存在于動植物和微生物中，是生物體內最重要的非蛋白巰基化合物之一，具有還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG），生物體內大量存在并起主要作用的是GSH，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內分泌疾病，并作為生物活性添加劑及抗氧化劑用于食品領域。

GSH由谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸（Gly）通過肽鍵形成，分子中有一特殊的γ肽鍵，即由谷氨酸的γ-COOH與半胱氨酸的α-NH2縮合成的肽鍵，它不同于蛋白質分子中的普通肽鍵。GSH為白色晶體，易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺。兩分子GSH脫氫后以二硫鍵相連形成氧化型谷胱甘肽（GSSG），又稱谷胱甘肽二硫化物，多以水合物形式存在，是溶于水的白色晶體。

目前谷胱甘肽的主要制備方法有：溶劑萃取法、化學合成法、生物發酵法和酶法。從谷物胚芽中提取GSH，由于GSH得率低、成本高、有機溶劑污染嚴重、純度不高，而且消耗大量糧食，現已很少使用。化學合成法合成GSH，由于活性產物不易分離，需要化學拆分，產品純度不高，難以推廣。

近年頗受重視的是將編碼GSH合成酶系的基因克隆到大腸桿菌或酵母中，使用微生物發酵生產GSH。酵母發酵法，工藝較成熟，但產量有待提高，而且下游工藝處理復雜。與三磷酸腺苷（ATP）再生體系偶聯合成GSH，乙酰激酶盡管效率較高，但乙酰磷酸的高價格及穩定性限制了此法的產業化；酵母糖酵解途徑成本低廉，雖在胞二磷膽堿和NADP的合成方面獲得成功，但合成GSH的效率較低，主要是ATP再生反應效率不高，反應條件與GSH酶系催化合成GSH的條件不協調以及由此造成的成本較高限制了此方法潛力的發揮。

近年來國內外GSH生產基本采用發酵法，酶法生產GSH的技術還未成形。有研究者提出用固定化酶技術生產GSH，通過調節GSH?I和GSH?II兩種酶的比例，將兩種酶固定在載體上，通過加入底物和ATP來生產GSH。但是該方法存在以下問題，直接限制了該技術的工業化應用：

1）GSH?I和GSH?II兩種酶固定在一起，無法解決兩步反應之間的相互抑制，影響了生產速度；

2）固定化酶技術未解決酶活性的穩定性問題，提高了生產酶的成本；以及

3）酶法合成的最大問題是ATP的來源，由于ATP價格昂貴，使得利用酶法合成GSH的成本比傳統發酵法高很多。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種大規模、低成本、工業化生產GSH的方法，解決目前酶法生產GSH存在的問題。

本發明提供了一種酶法制備谷胱甘肽的方法，包括以下步驟：

（1）在反應罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸；

（2）在過濾器E1中分離GSH?I酶；

（3）在反應罐B中生成谷胱甘肽；

（4）在過濾器E2中分離GSH?II酶；以及

（5）分離產物GSH。

本發明方法進一步包括以下步驟：

（6）在再生罐C中利用二磷酸腺苷（ADP）和/或磷酸腺苷（AMP）再生ATP，并分離生成的ATP。

本發明方法還可進一步包括以下步驟：

（7）所述步驟（2）中分離的GSH?I酶的循環利用，即將分離的GSH?I酶添加至反應罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的連續反應；以及

（8）GSH?I酶的連續分離，即在過濾器E1中連續分離GSH?I酶。

本發明方法還可進一步包括以下步驟：

（9）所述步驟（4）中分離的GSH?II酶的循環利用，即將分離的GSH?II酶添加至反應罐B中生成谷胱甘肽的連續反應；以及

（10）GSH?II酶的連續分離，即在過濾器E2中連續分離GSH?II酶。

本發明方法還進一步包括以下步驟：

（11）產物GSH的連續分離。

在本發明方法中，循環利用GSH?I酶和GSH?II酶、以及再生ATP至少一次，即重復所述步驟（6）至所述步驟（11）至少一次，優選重復多次，例如重復2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50次等。

本發明方法中，在反應罐A中生成γ-谷氨酰半胱氨酸的反應如下：

反應溫度為25-60℃，優選30-55℃，更優選35-50℃，最優選37-45℃；

反應PH為5-10，優選6-10，更優選7-9的條件下；