[發明專利]一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價方法

無效

• 申請號: 201210201680.4
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN102747129A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 程娜;李志遠;徐慧娟;梁洞泉
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N21/31
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 莫瑤江;劉明星

技術領域：

本發明屬于醫學領域，具體涉及一種高效評估藥物對hERG通道安全性的評價方法。

背景技術：

QT間期指心電圖上測量心跳電循環中Q波與T波這個時間段，代表心肌細胞從去極化到復極化整個過程。長QT綜合癥（long?QTsyndrome，LQTs）分為先天性長QT綜合癥（co?ngenital?long?QT?syndrome）和獲得性長QT綜合癥（acquired?long?QT?syndrome）。先天性長QT綜合征是因編碼心肌細胞膜離子通道蛋白的基因突變導致離子通道功能障礙而引起的。藥物是引起獲得性長QT綜合癥的重要原因。當QT間期明顯延長時，可能導致尖端扭轉型室速（TdP），TdP具有自限性，也可能進一步發展為室顫引起死亡。引起獲得性長QT綜合癥的藥物幾乎都作用于一種特異性K⁺電流-快速激活的延遲整流鉀電流（IKr）。IKr是由位于第7對染色體上的人hERG，(也稱KCNH2）基因表達的產物。2005年起，G7各發達國家開始執行由歐盟、日本和美國的藥品法規機構和大型制藥企業聯合制定的關于心臟安全評估的S7B法規。隨著時間的推移，S7B法規將會逐漸被各國的藥物管理局和制藥公司所接受。據統計，25%~40%的先導化合物都顯示出不同程度的hERG通道相關的心臟毒性。因此，候選藥物的hERG安全性評價是藥物開發過程中至關重要的一環。

hERG通道安全性評價作為新藥臨床前試驗一個很重要的部分，經典的檢測方法采用膜片鉗技術進行評價，該方法實驗設備較昂貴，對技術人員的要求較高，且由于手動膜片鉗技術自身缺陷使得hERG通道安全性評價效率很低。

發明內容：

本發明的目的是提供一種具有高通量、自動化、高效率、操作簡便等特點的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價方法。

本發明的高效評估藥物對hERG通道安全性的評價方法，其特征在于，包括以下步驟：

常規培養表達hERG通道的細胞株，然后棄去其培養基，將細胞株加入到固定緩沖液中，在細胞株的常規培養條件下孵育1-4h，然后棄去固定緩沖液，再加入含待檢藥物的固定緩沖液，孵育5-40min，再棄去含待檢藥物的固定緩沖液，用洗滌緩沖液洗滌細胞株，洗掉殘留Rb⁺，然后再加入離子通道開放緩沖液，孵育5-20min，移去細胞上清液，將細胞株裂解得細胞裂解液，分別測定細胞上清液和細胞裂解液中的Rb⁺濃度；再將上述含待檢藥物的固定緩沖液中的待檢藥物設定為其他不同濃度，按照上述方法重復測定，根據不同濃度的待檢藥物的測定所得的數據，得到該待檢藥物的IC₅₀值，如果IC₅₀值≤1000μmol/L就認為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC₅₀值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風險越大。根據《2011藥品注冊的國際技術要求安全部分》，體外哺乳動物細胞試驗的最高濃度為1000μmol/L，因此如果IC₅₀值≤1000μmol/L就認為該待檢藥物對hERG通道具有一定的阻滯作用，IC₅₀值越小，說明該藥物對hERG通道的抑制作用越大，心肌毒性的風險越大；

所述的固定緩沖液：RbCl?2-10mM，NaCl?120-180mM，CaCl₂?1-3mM，NaH₂PO₄0.4-1.2mM，MgCl₂0.8-1.2mM，glucose?3-7mM、HEPES?20-30mM，余量為水。每升固定緩沖液的配置方法為：在水中加入RbCl?2-10mmol，NaCl?120-180mmol，CaCl₂?1-3mmol，NaH₂PO₄0.4-1.2mmol，MgCl₂0.8-1.2mmol，glucose?3-7mmol、HEPES?20-30mmol，待溶解完全后定容至1L，PH用NaOH調至7.4，過濾分裝，4度保存待用。用滲透壓儀調節滲透壓在生理鹽水和人體的正常滲透壓范圍，290–320mOsm。