[發明專利]腸出血性大腸桿菌O157:H7多價fliC-hcpA-tir-eae重組菌及疫苗

無效

• 申請號: 201210201255.5
• 申請日: 2012-06-19
• 公開（公告）號: CN102747024A
• 公開（公告）日: 2012-10-24
• 發明（設計）人: 張雪寒;何孔旺;葉青;欒曉婷;倪艷秀;溫立斌;郭容利;李彬;周俊明;王小敏;呂立新;俞正玉;茅愛華
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/70;C07K19/00;C12P21/02;A61K39/116;A61P31/04;C12R1/19
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

一、技術領域

本發明涉及腸出血性大腸桿菌O157:H7多價融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，屬于生物制藥領域。

二、背景技術

腸出血性大腸桿菌（enterohaemorrhagic?Escherichia?coli，EHEC）是重要的食源性人獸共患病原，O157:H7是其重要的血清型。近20余年來，EHEC?O157:H7引發的食物中毒在世界各地包括中國都有不同規模的暴發流行。EHEC?O157:H7感染患者和無癥狀攜帶者可作為傳染源。在動物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動物帶菌率較高。相對來講，動物作為傳染源要比人類更為重要，它往往是動物源食品污染的根源。

人類感染可引起嚴重的胃腸道和循環系統疾病，如出血性結腸炎（hemorrhagic?Colitis，HC）、溶血尿毒綜合征（Haemolytic?uraemic?syndrome，HUS）等，個別患者可因急性和慢性腎功能衰竭而死亡。動物感染一般不引發明顯的臨床癥狀，但能夠長期甚至終生攜帶。EHEC動物宿主范圍非常廣泛，其中反芻動物帶菌率較高。因此，防控EHEC?O157:H7的重中之重是減少和控制動物帶菌和排菌。

目前，對O157:H7的感染缺乏有效的防治方法，只能給予對癥治療和適當的抗菌治療。由于O157:H7的暴發流行特點和治療上的困難，疫苗研究就顯得極為緊迫。有效的疫苗研制是預防和治療O157:H7感染最簡單、經濟和快捷的手段。

選取與EHEC?O157:H7粘附和定植密切相關的鞭毛（H7）、菌毛（HCP）和緊密素（Intimin）和轉位緊密素受體（Tir）四個基因分別設計特異性引物對，擴增相應基因片段，并依次串聯，構建重組菌，獲得重組蛋白，制備亞單位疫苗，用于預防EHEC?O157:H7在動物體內的定植。

三、發現內容

技術問題??本發明目的在于構建EHEC?O157:H7多價融合型重組菌，表達重組蛋白，進而研制亞單位疫苗。本發明在抗原選擇上直接針對EHEC?O157:H7重要的粘附因子，強調多個粘附因子的聯合應用以產生最大的免疫保護作用，降低動物帶菌率，進而減少人類感染EHEC的機會，保障人類身心健康。

技術方案??本發明的具體實施方案如下：

腸出血性大腸桿菌O157:H7（EHEC?O157:H7）多價融合型重組菌、重組蛋白制備方法及亞單位疫苗，其特征在于，所說的多價重組菌和重組蛋白為BL21（pColdⅠ-fliC-hcpA-tir-eae）。多價重組菌和重組蛋白的制備方法包括：

（1）腸出血性大腸桿菌O157:H7免疫多價融合型重組菌，其構建方法為：

根據GenBank中O157:H7?EDL933?的fliC、hcpA、tir和eae基因序列分別設計引物，并分別在上下游引物兩端加入酶切位點（下劃線部分），在hcpA基因后和eae基因前分別加入長度為24個核苷酸的連接片段，引物序列如下：

fliC-P1：5-ggggagctcactattaccaacaaa-3??????????????????Sac?Ⅰ

fliC-P2：5-ttactcgagggtcgttgcagaacc-3??????????????????Xhol?Ⅰ

hcpA-P1：5-gggctcgagtttacacttatcgaactgat-3??????????????Xhol?Ⅰ

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