[發明專利]預防奶牛乳房炎用GIT融合蛋白的制備及應用

無效

• 申請號: 201210199900.4
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN102731660A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 崔玉東;樊自堯;孫虎男;朱戰波
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/21;A61K39/116;A61K39/085;A61K39/09;A61P31/04
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

技術領域

本發明屬于基因工程領域，涉及一種預防奶牛乳房炎用GapC_id-IsdB_id-TRAP（以下簡稱GIT）融合蛋白的制備及應用，特備是一種能夠制備停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌及金黃色葡萄球菌疫苗的GIT融合蛋白。

背景技術

奶牛乳房炎是嚴重危害奶牛業的重要疾病，所造成的經濟損失巨大，一直是世界性難題。該病的病因主要是細菌感染，其中以金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）和鏈球菌感染最為常見，占臨床發病率的55%-80%。隨著抗生素在細菌感染治療中的普遍使用，已出現了大量耐藥菌株，致使抗生素治療收效甚微，而且對無抗乳的要求也限制了抗生素的使用。因此，免疫預防便成為奶牛乳房炎的防治的最佳選擇。隨著研究不斷深入和大量的臨床實踐證實，傳統疫苗如金黃色葡萄球菌全菌體滅活苗、莢膜多糖結合苗等不僅保護效果不理想，而且免疫保護效果也不穩定。近年來研究表明，基因工程亞單位疫苗在預防金黃色葡萄球菌和鏈球菌感染方面顯現出令人振奮的效果，并使其成為近年來的研究熱點。但由于奶牛乳房炎是個多病原性疾病，單一的金黃色葡萄球菌亞單位苗或某一種鏈球菌亞單位苗都無法滿足臨床需要。為此，我們試圖將幾種亞單位苗混合在一起進行免疫接種以做到一針免疫接種起到預防幾種細菌感染的效果，研究中發現可能是亞單位疫苗各成分相互干擾的原因，幾種亞單位苗混合在一起進行免疫所產生的免疫保護作用遠不及幾種抗原的融合蛋白免疫保護效果。

經過對金黃色葡萄球菌保護性抗原研究證實，金黃色葡萄球菌的TRAP蛋白和IsdB蛋白具有高度保守性和較好的免疫原性，將TRAP和IsdB免疫優勢片段（IsdB_id）串聯，所得融合蛋白的免疫保護作用顯著好于各蛋白單獨免疫接種；研究還證實，停乳鏈球菌（Streptococcus?dysgalactiae）GapC蛋白能較好地預防實驗小鼠感染停乳鏈球菌（Streptococcus?dysgalactiae）、無乳鏈球菌（Streptococcus?agalactiae）和乳房鏈球菌（Streptococcus?uberis）。因此，需要發明一種能夠綜合以上各種效果的融合蛋白作為疫苗應用，防治奶牛乳房炎。

發明內容

本發明的第一個目的是提供預防奶牛乳房炎用GIT融合蛋白和其氨基酸序列（SEQ?ID?No.1），通過將GapC免疫優勢片段（GapC_id）和IsdB_id-TRAP蛋白進行融合，制備出新的GapC_id-IsdB_id-TRAP融合蛋白，命名為GIT。

本發明的第二個目的是提供編碼GIT的基因和其核苷酸序列（SEQ?ID?No.2）。

本發明的第三個目的是提供含有編碼基因的表達載體GIT-PET32a以及含有表達載體的宿主細胞。

本發明的第四個目的是提供GIT的制備方法，即用表達載體GIT-PET32a轉化宿主細胞進行異源表達，并對表達蛋白進行純化。

本發明的最后一個目的是提供GIT在制備停乳鏈球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌及金黃色葡萄球菌疫苗中的應用。

本發明通過以下技術方案來實現：本發明的GIT融合蛋白，是由停乳鏈球菌（Streptococcus?dysgalactiae）的GapC免疫優勢片段、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus?aureus）的IsdB免疫優勢片段和TRAP融合而成。

首先以含有停乳鏈球菌GapC基因的重組表達質粒為模板或以提取的停乳鏈球菌DNA為模板，通過PCR方法擴增獲得GapC基因，然后通過生物信息學分析將GapC分為2個片段，并通過免疫原性分析和免疫保護作用研究，選擇和確定GapC免疫優勢區（GapC_id）。在此基礎上，通過生物信息學方法設計新融合蛋白順序，通過重疊延伸PCR方法將GapC_id與IsdBid-TRAP進行基因融合，并將該融合基因插入到表達載體pET-32a，轉化大腸桿菌，經IPTG誘導后可獲得表達的可溶性融合蛋白GIT。

用Resin蛋白純化系統純化表達的GIT融合蛋白，并將純化后的融合蛋白與弗氏佐劑混合制備疫苗免疫動物，然后進行免疫細胞分化、抗體和細胞因子水平檢測以及采用不同菌種（金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、無乳鏈球菌和乳房鏈球菌）進行攻毒實驗以驗證功能。