[發明專利]一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵制備亮氨酸氨肽酶的方法

無效

• 申請號: 201210199820.9
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN102703407A
• 公開（公告）日: 2012-10-03
• 發明（設計）人: 田亞平;曹松龍;林穎;高新星
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12R1/125
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所 32104
• 代理人: 時旭丹;劉品超

技術領域

一種枯草芽孢桿菌工程菌發酵制備亮氨酸氨肽酶的方法，具體地說是利用枯草芽孢桿菌工程菌發酵，收集發酵液，通過絮凝、過濾、超濾濃縮、冷凍干燥等提取操作，獲得亮氨酸氨肽酶制品，屬于酶制劑、食品添加劑技術領域。

背景技術

蛋白酶的商品生產始于20世紀初，30年代微生物蛋白酶開始應用于食品和制革工業，近年來，微生物產酶的研究蓬勃發展。20世紀50年代初，日本學者首先發現霉菌中存在幾種類型的蛋白酶，特別是酸性蛋白酶，20世紀60年代初，荷蘭開始生產添加堿性蛋白酶的洗滌劑。到目前為止，國際市場上商品蛋白酶達100種以上。

蛋白酶制劑在蛋白加工領域中主要被用于改良風味、改善營養價值、生產抽提物、以及改變物理性質等。廣義上，蛋白酶制劑包括兩種類型：一類是蛋白酶，它能分解蛋白生成多肽或寡肽；另一類是肽酶，它能從末端開始切割蛋白和肽鏈并釋放出游離單個氨基酸。酶作為生物催化劑具有反應條件溫和、催化效率高和專一性強等優點，并因其高效、節能、經濟、綠色、環保等的特點，其應用范圍已遍及工業生產、農業、醫療診斷、環境保護、食品加工等領域。由于食品工業生產規模的日益擴大，食品行業的快速發展，食品添加劑特別是天然鮮味劑的需求也得到了快速增長。營養性天然鮮味劑是一類含氨基酸、肽類、核苷酸和糖分等物質并具有魚肉和蔬菜等風味的調味料，主要包括動植物提取浸膏、蛋白質水解濃縮物和酵母浸膏等。

酶制劑是發酵產業的核心產品，酶制劑行業推動了發酵工業和相關行業的發展，并產生了巨大的經濟和社會效益。目前，我國酶制劑行業發展較快，基本上滿足了大宗產品生產的需求。但是在產品方面，要進一步提升新酶種的結構比例，特別是國外完全壟斷的小酶品種。同時，加快開發和生產復合酶制劑，包括食品、紡織、飼料、紙漿、制革、造紙等專用復合酶制劑。此外，繼續提高現有酶制劑酶的活性，提高產品檔次。國內在氨肽酶生產方面的研究處于快速發展研究的階段，實現產業化，填補國內產品的空白，替代進口產品，增強我國酶制劑行業競爭力，打破該產品被國外的壟斷有著重要的意義。

目前蛋白質的水解方式逐漸從化學法向酶解法轉變。用傳統的方式水解蛋白質制備活性多肽，已經不能滿足現代人民生活要求，在科技日新月異的今天，酶解蛋白質生產多肽已成為當今熱門研究，通過不同的酶切方式可以獲得不同功能的活性多肽，關于這方面已有很多相關的報道。大豆蛋白水解生產大豆多肽是大豆深加工的一個重要方向，因為大豆多肽不僅具有良好的營養特性，還具有廣泛的生理藥理作用和比大豆蛋白更豐富的功能特性，所以大豆多肽是一種很有前景的功能性食品原料。隨著生物技術的進步和生命科學的發展，生理活性肽的生理功能逐步被人們發現，并受到越來越多的重視，尤其是一些活性肽的結構和生理功能逐漸明確，推動了活性肽的研究，也促進了大豆肽的研究與開發。

大豆多肽產品帶有不同程度的苦味會直接影響食品的風味，給人們食用時會有一些“不愉快”，也在一定程度上限制了它在食品工業中的推廣應用。研究證實當疏水性氨基酸殘基處于多肽鏈的外側時多肽呈現苦味，而單個的疏水性氨基酸苦味卻低的多，因此采用外切酶將疏水性氨基酸從多肽鏈末端切去可以有效地減少苦味。另外該氨肽酶與其他蛋白酶復合使用，可以大幅度提高蛋白質的水解度，在醬油釀造、干酪生產中，可以提高蛋白質的利用率，節約成本。在醫學研究中，該氨肽酶可用作醫學上的解毒劑，也可用作環境消毒劑，亮氨酸氨肽酶還可用作蛋白質序列測定的分子工具。

一株野生枯草芽孢桿菌zj016經過傳統誘變育種和發酵過程優化，發酵產酶的酶活單位可達7000U/L。本發明對在野生枯草芽孢桿菌zj016基礎上成功構建的高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，進一步進行發酵過程優化，采用培養基的預處理、培養基組成的調整、溶氧水平的控制等策略，使7L發酵罐產亮氨酸氨肽酶酶活得到大幅度提高，達到200000U/L左右。

發明內容

本發明是利用一株高產亮氨酸氨肽酶的枯草芽孢桿菌工程菌，通過發酵培養、絮凝、過濾除菌、超濾濃縮、冷凍干燥等操作，獲得固體亮氨酸氨肽酶，整個流程的收率為72.8%，酶粉酶活為7500?U/g，所得的固體酶的基本特性：最適溫度50℃，溫度穩定范圍30～60℃，最適pH8.5，pH穩定范圍6.0～9.5，存在一定的底物特異性，已發現其對多肽N端一種疏水的亮氨酸，一種堿性的精氨酸有較強水解作用。