[發明專利]一種高靈敏檢測t-DNA的SERS液相芯片方法

有效

• 申請號: 201210199701.3
• 申請日: 2012-06-18
• 公開（公告）號: CN102721680A
• 公開（公告）日: 2012-10-10
• 發明（設計）人: 汪長春;李菊梅
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;盛志范

技術領域

本發明屬于生物分子檢測技術領域，具體涉及一種高靈敏檢測t-DNA的SERS液相芯片方法。

背景技術

DNA分子的檢測在基因治療、食品安全監測、醫學診斷、法醫分析、文物鑒定等領域具有重要的應用價值。目前，使用最多的檢測方法是熒光光譜法。但是熒光易于淬滅導致熒光信號的重現性極差。另外熒光發射光譜較寬（有機熒光染料的半高譜寬為50～100?nm，量子點的半高譜寬為25～40?nm），導致發射光譜易重疊，因而熒光光譜的分辨率很低（Sun,?L.;?Yu,?C.?X.;?Irudayaraj,?J.?Anal.?Chem.?2007,?79,?3981-3988）。與熒光光譜相比，表面增強拉曼散射光譜（SERS）在DNA檢測方面具有如下優勢：一、SERS光譜能夠提供豐富的分子振動信息，SERS光譜譜峰狹窄（半高寬約1?nm），因而SERS光譜具有很高的光譜分辨率。二、拉曼活性分子光穩定性高，SERS信號的重現性好（Mulvaney,?S.?P.;?Musick,?M.?D.;?Keating,?C.?D.;?Natan,?M.?J.?Langmuir?2003,?19,?4784-4790）。因此，目前SERS光譜已逐漸取代了熒光光譜，成為生物分析領域普遍應用的檢測方法。

應用SERS光譜檢測DNA的基本方法是“三明治”雜化分析法，目前常用的固定基底是片膜芯片。Mirkin?課題組首先將一端具有巰基和一端結合了拉曼活性分子的p-DNA吸附到金納米粒子表面制成SERS探針，并將平面芯片共價結合c-DNA制成捕獲基底，然后采用“三明治”雜化分析方法檢測t-DNA。實驗結果得到檢測限為20?fM，而且該方法具有較高的選擇性和光譜分辨率，并能夠檢測單個堿基錯配的DNA序列(Cao,?Y.?W.?C.;?Jin,?R.?C.;?Mirkin,?C.?A.?Science?2002,?297,?1536-1540)。Braun等將光滑的銀納米膜結合c-DNA作為捕獲基底，當形成雜化復合物后，SERS探針中的銀納米粒子與銀納米膜基底緊密靠在一起產生巨大的SERS信號（Braun,?G.;?Lee,?S.?J.;?Dante,?M.;?Nguyen,?T.?Q.;?Moskovits,?M.;?Reich,?N.J.?Am.?Chem.?Soc.?2007,?129,?6378-6379）。片膜芯片固定基底制備方法簡單，但是存在以下缺點：（1）DNA鏈之間的雜交反應在固相中進行，大大降低了DNA鏈之間的雜交效率；（2）片膜芯片的比表面積較小，大大限制了c-DNA的結合容量；（3）由于c-DNA結合在整個芯片表面，因而SERS探針平均分布在整個基底表面（遠遠大于SERS檢測的激光光斑面積），從而分散了SERS探針的信號強度，降低了檢測靈敏度。因此，開發簡便、高效、高靈敏和高通量的DNA檢測方法仍是近年研究的熱點。

發明內容

本發明的目的在于提供一種簡便、高效、高靈敏檢測t-DNA的SERS液相芯片方法。

本發明針對背景技術中所存在的問題，提出了一種采用具有高靈敏度和高穩定性的SERS編碼微球為SERS探針，具有高比表面積和快速磁響應性的磁性復合納米粒子為固定基底的SERS液相芯片檢測t-DNA的方法。磁性復合納米粒子具有快速的磁響應性能、良好的生物相容性能和較高的DNA捕獲容量和效率；基于SERS探針和磁性復合納米粒子構建的SERS液相芯片方法具有高檢測靈敏度、高定量檢測能力和高多元檢測能力。

本發明是通過以下三步技術方案實現的，第一步制備SERS探針：首先使用氨基硅烷偶聯劑為功能化合物，采用溶膠凝膠方法將包覆二氧化硅殼層的SERS標簽的表面改性為氨基基團，然后利用氨基和丁二酸酐的開環反應，得到表面修飾羧基的SERS標簽，最后利用SERS標簽表面的羧基與p-DNA末端的氨基發生酰胺化反應得到SERS探針。第二步制備磁性捕獲基底：通過碳二亞胺方法使磁性復合納米粒子表面的羧基和c-DNA末端的氨基發生酰胺化反應得到磁性捕獲基底。第三步構建SERS液相芯片方法：使用t-DNA與匹配的SERS探針和磁性復合納米粒子構建SERS液相芯片在溶液中采用“三明治”雜化分析方法檢測t-DNA（如圖1所示）。

本發明提供的一種高靈敏檢測t-DNA的SERS液相芯片方法，具體步驟如下：

1．制備SERS探針