[發明專利]胰島素-Fc融合蛋白

有效

• 申請號: 201210198941.1
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN103509118A
• 公開（公告）日: 2014-01-15
• 發明（設計）人: 顧娜娜;郭懷祖
• 申請（專利權）人: 郭懷祖
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;A61K47/48;A61K38/28;A61P3/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體地，本發明公開了一種融合蛋白、其制備方法和用途。

背景技術

糖尿病是一種日漸普遍的流行病，據估計，到2025年，糖尿病將影響3億以上的人口，因此急需一種有效的藥物治療方法。2型糖尿病占所有病例的90-95％。因血糖水平持續升高引起的并發癥包括心血管疾病、腎病、神經病和視網膜病。此外，在2型糖尿病晚期時，胰腺的β細胞死亡，從而停止分泌胰島素。目前對糖尿病的治療會產生多種有害的副作用，其中包括低血糖和體重增加。此外，目前對2型糖尿病的治療并不能治愈這種疾病，而只是延緩時間，直至患者需要接受胰島素治療。

胰島素這樣的天然或者重組蛋白在水溶液狀態下半保存期通常比較短，由于這些分子制劑的不穩定性使之必須凍干保存，給運輸和保存帶來不便。

胰島素類的重組治療蛋白的體內半衰期也很短，為了使用藥間隔延長，必須生產體內半衰期長的藥物。

發明內容

本發明公開了一種胰島素-Fc融合蛋白，其通式為

B-C-A-Fc，其中A為胰島素A鏈，B為胰島素的B鏈，C為4-50個氨基酸的C肽連接序列，優選為6-30個氨基酸，Fc為免疫球蛋白Fc段或其突變體。

優選地，C為GGGPGKR、GGGPQT、GGGPGAG、AAGGGPSVR之一；C可以是天然或者人工序列，序列長度在4-50之間，主要為6-30個氨基酸。天然序列可以通過替代，增減修飾形成人工序列。為了減少免疫反應，C優選包含人血液中的天然人蛋白序列，例如天然胰島素C肽序列(RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKR)、IGF-I?C肽連接(GYGSSRRAPQT)，抗體重鏈鉸鏈區序列(EPKSCDKTHTCPPCPAP)等。在有些結構中連接序列也可以只包含部分的上述序列，或者替代、增減修飾上述序列中一個或者幾個氨基酸。連接序列可以被增減某個特定氨基酸。但是在一些結構中，連接序列不能包含兩個連續的堿性氨基酸，例如KK，RR，RK。選擇沒有賴氨酸或者精氨酸的序列，或者選擇沒有酪氨酸的序列作為連接序列。

融合蛋白序列還包含一個N端的引導序列或者信號肽。例如抗體的信號肽，胰島素的引導序列，酵母a因子信號序列，白蛋白信號肽序列，胰島素樣生長因子結合蛋白4信號肽序列，酸性磷酸酶信號肽序列等等。

在本發明中，該構造的抗體Fc部分保留了結合蛋白質A的能力并且可以利用蛋白質A親和色譜法進行純化。通過重組方法合成，并且可以代表任何人類或動物抗體的任一亞型。公眾可從某些出版物(例如Kabat，et?al.Sequences?of?Proteins?of?Immunological?Interest，U.S.Dept.Health(1983)(Kabat等人，免疫學相關蛋白質序列，美國衛生部，1983年))或在線獲得人和動物免疫球蛋白的序列。抗體的Fc區域通過對其Fc受體結合區域(H235-H236)進行突變例如從亮氨酸突變為丙氨酸，可降低補體結合、抗體依賴細胞介導的細胞毒性(ADCC)以及通過將該二聚體結構的亞區與免疫細胞表面受體(Fcγ受體)結合來介導的其他功能。

融合蛋白的基因可以連入真核表達載體pcdna3.1，pngfpN，PEE144等真核載體，轉染CHO，NS0，SP2/0等細胞進行表達，或者連入pet22，pet32，Pgex等質粒轉染BL21(DE3)，ROSETTA，AD494等菌株進行表達，或者連入pPICZ等載體轉染畢赤酵母進行酵母表達。

融合蛋白可以通過proteinA親和層析柱，proteinG親和層析柱以及其它層析柱純化獲得高純度的蛋白分子。

本發明所述的胰島素-Fc融合蛋白具有胰島素活性，能夠結合胰島素受體，刺激表達胰島素受體的細胞攝取葡萄糖。胰島素-Fc融合蛋白包含通過連接序列連接的A鏈和B鏈，例如胰島素-Fc融合蛋白包括抗體的Fc段或其突變體通過N端或者C端與胰島素類似物連接，其胰島素類似物公式為-B-C-A-，其中C為C肽連接序列。在一些實例中，連接序列為6-30個氨基酸，一般情況下，連接序列可以使A鏈和B鏈形成具有胰島素活性的分子。