[發明專利]一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子

有效

• 申請號: 201210197844.0
• 申請日: 2012-06-13
• 公開（公告）號: CN102732521A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 錢亞娟;張潔;周雪平;吳建祥
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N15/82;C12N5/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 張法高

技術領域

本發明涉及一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子。具體地說，本發明涉及中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的βC1ORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子序列的分離。本發明也涉及含有連接異源基因的中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的βC1ORF缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子的載體盒的構建。另外，本發明也涉及利用含有中國番茄黃曲葉病毒beta衛星的βC1ORF各種啟動子的表達載體進行瞬間表達和穩定表達的方法。?

背景技術

植物基因工程的目的是將外源基因導入受體植物后使其正確而有效地表達，而啟動子對外源基因的表達水平影響很大，是基因工程表達載體的重要元件。人們可根據需要選擇或人工構建合適的啟動子來研究新基因的功能，闡明生物體的生長發育及其他生命周期的過程與機理，目前已有許多不同來源的啟動子被用于植物品質改良基因工程、抗病育種基因工程以及植物生物反應器等基因工程領域。這些啟動子中一大類是從根癌農桿菌中分離出來，另一大類為植物本身來源的啟動子。相比上述啟動子控制的目標基因表達量往往較低，或者與受體植物細胞基因組序列具有一定的同源性的劣勢，植物病毒啟動子在植物遺傳轉化中有著不可或缺的優勢。已經鑒定的植物病毒啟動子，主要包括組成型表達啟動子和組織特異性表達啟動子。組成型啟動子能夠驅動外源基因在植物不同組織或器官以及不同的發育階段持續和穩定的表達，不表現時空特異性，也不受外界因素的誘導。其中花椰菜花葉病毒(CaMV）35S啟動子在雙子葉植物基因表達中被廣泛應用，它具有多種順式作用元件，利用CaMV?35S核心啟動子與CaMV?35S啟動子的5’端不同區段和煙草花葉病毒(TMV)的5’非轉錄區（omega序列）相連，發現該啟動子可驅動報告基因在雙子葉植物煙草和單子葉植物水稻中均高效表達。有研究表明利用CaMV?35S啟動子的串聯重復序列作為啟動子元件能較大幅度地提高啟動子活性，而進一步的研究表明啟動子元件或片段的重復雖然能夠提高其表達活性，但啟動子的表達模式不會改變。因此，通過對啟動子進行改造有可能提高啟動子驅動外源基因表達的能力，從而為外源基因高效表達載體的構建及應用打下良好基礎。?

雙生病毒是世界范圍內廣泛存在的一類具有孿生顆粒形態的植物單鏈DNA病毒。beta衛星是與某些單組份雙生病毒相伴隨的一類分子，該分子大小約1.3?kb，是其輔助病毒基因組的一半左右。beta衛星分子依賴于其輔助病毒進行DNA復制、移動和包裹。其基因組中除了存在一個富含腺嘌呤的區域(A-rich?region)和一個衛星保守區(SCR)外，還存在一個大小、位置和氨基酸序列上高度保守的βC1ORF，現已證實其與致病性緊密相關，它的缺失并不影響beta衛星的復制，并且已有實驗表明beta衛星可以作為病毒誘導的基因沉默載體進行遺傳操作。已鑒定來源于中國番茄黃曲葉病毒Y10分離物相伴隨的beta衛星分子的啟動子為韌皮部特異性表達的啟動子，而本研究中來源于中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛星分子和上述beta衛星分子同源性達78.7％，屬于同一衛星分子的不同分離物，但是兩者在致病表型上卻有比較大的差異，推測該beta衛星的啟動子在表達類型上也有別于上述beta衛星的啟動子，有可能為植物基因表達提供一些有價值的表達元件，并為兩類beta衛星分子不同致病性機理的研究打下良好的分子生物學方面的基礎。因此，本發明的開展既可以通過了解決定致病相關蛋白βC1的啟動子的活性，有助于了解雙生病毒致病性和侵染的機理，并且可以為不同目的的植物基因工程提供合適類型的啟動子，為植物基因工程的迅速做出一定貢獻。已知βC1ORF啟動子是影響病毒衛星載體表達效率的重要因素，而該啟動子的表達類型也決定了其在植物遺傳轉化中的應用價值，本發明分析了中國番茄黃曲葉病毒Y25分離物相伴隨的beta衛星分子中βC1ORF的缺失啟動子、全長啟動子和串聯啟動子的表達活性以及全長啟動子的表達類型。?

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子。?

中國番茄黃曲葉病毒衛星的組成型表達啟動子：所述啟動子DNA序列為中國番茄黃曲葉病毒beta衛星分子的βC1ORF的缺失啟動子SEQ?ID?NO:1、全長啟動子SEQ?ID?NO:2或串聯啟動子SEQ?ID?NO:3所示DNA序列。?