[發(fā)明專利]一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達(dá)載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210197611.0
• 申請(qǐng)日: 2012-06-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102719454A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李加琪;賀艷芬;張哲;張豪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/53
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/53;C12N15/63;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/85;A01K67/027;C12R1/01
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因及其表達(dá)載體。

背景技術(shù)

畜牧業(yè)規(guī)?；B(yǎng)豬產(chǎn)生的廢氣對(duì)周?chē)h(huán)境造成了較大的污染，而H₂S是產(chǎn)生惡臭氣味的重要因素之一，可使畜禽生產(chǎn)性能下降，造成幼仔中毒死亡，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民生活都造成較大的影響。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，培育減排H₂S的環(huán)境友好型轉(zhuǎn)基因豬便成為可能，它可以從根本上緩解養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題。生活在潮濕惡臭環(huán)境中的光合細(xì)菌莢膜紅細(xì)菌（Rhodobacter?capsulatus）中產(chǎn)生一種膜結(jié)合蛋白-硫化物醌氧化還原酶（Sulfide-quinone?reductase，SQR），可以利用H₂S作為氫供體為光合細(xì)菌提供能量。

雖然莢膜紅細(xì)菌可以產(chǎn)生SQR蛋白，但因該細(xì)菌生長(zhǎng)條件較難控制，將其進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)仍然受到限制，所以如何制備適于工業(yè)化生產(chǎn)的重組細(xì)菌成為目前研究的課題。

外源蛋白的表達(dá)水平與多種因素有關(guān)，如啟動(dòng)子和終止子的強(qiáng)弱、質(zhì)?？截悢?shù)、蛋白穩(wěn)定性、翻譯效率，表達(dá)系統(tǒng)和宿主的兼容性等。其中，宿主密碼子偏好性是影響外源蛋白表達(dá)的重要因素之一。無(wú)論在原核表達(dá)系統(tǒng)還是真核表達(dá)系統(tǒng)，稀有密碼子過(guò)多會(huì)嚴(yán)重影響蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)水平急劇下降；而偏離規(guī)范的密碼子，即不同的生物能把同種密碼子識(shí)別為不同的氨基酸，將直接導(dǎo)致了基因不能進(jìn)行異源表達(dá)或者只表達(dá)出無(wú)活性的蛋白質(zhì)。目前，克服制約瓶頸現(xiàn)象解決的主要策略是在不改變所編碼蛋白的氨基酸序列基礎(chǔ)上，通過(guò)序列定點(diǎn)突變或全基因合成手段，從基因本身更改特有的稀有密碼子從而實(shí)現(xiàn)功能蛋白的異源表達(dá)。而對(duì)于SQR蛋白的基因優(yōu)化目前還屬于空白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因。

本發(fā)明的另一目的是提供上述優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

一種優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。

本研究對(duì)sqr基因進(jìn)行優(yōu)化的時(shí)候兼顧以下幾個(gè)方面：盡量使用偏好密碼子，以提高mRNA的翻譯效率；降低GC含量，調(diào)整基因AT含量，防止提前終止；去除sqr基因中影響mRNA有效翻譯和穩(wěn)定性的二級(jí)結(jié)構(gòu)；除去使mRNA不穩(wěn)定和降解的序列和結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)表明優(yōu)化后的基因在CHO細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平均高于其原始基因序列。優(yōu)化后的sqr基因片段核苷酸序列與原序列比對(duì)相似性為81%，427個(gè)氨基酸中有228個(gè)氨基酸的密碼子得到優(yōu)化，優(yōu)化率達(dá)到54%。

一種硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是由優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因插入到表達(dá)載體（也稱出發(fā)載體）的多克隆位點(diǎn)構(gòu)建而成。所述出發(fā)載體優(yōu)選原核表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體pRSET?A、或真核表達(dá)載體pcDNA3.1。

一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，是由上述硫化物醌氧化還原酶的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞構(gòu)建而成。

本發(fā)明的優(yōu)化的硫化物醌氧化還原酶基因在制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本研究對(duì)光合細(xì)菌（莢膜紅細(xì)菌）中的硫化物醌還原酶（sqr）基因進(jìn)行了優(yōu)化，使其在表達(dá)量上高出正常菌株，從培育環(huán)境友好型動(dòng)物新品種的角度出發(fā)，為轉(zhuǎn)基因豬的制備探路，以期從轉(zhuǎn)基因全新的角度降低養(yǎng)殖場(chǎng)中硫化氫氣體的排放，從根本上解決養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)中的環(huán)境污染問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1.?莢膜紅細(xì)菌sqr2基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1、2為sqr2基因；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2?.sqr基因的信號(hào)肽預(yù)測(cè)。

圖3.?sqr基因優(yōu)化前后的CAI值及密碼子頻率分布。

圖4.?sqr基因優(yōu)化前后mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖5.?重組質(zhì)粒pRSET?A-sqr的菌液PCR鑒定，1：陰性對(duì)照；2~5：PCR擴(kuò)增重組質(zhì)粒pRSET?A-sqr；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

圖6.?不同誘導(dǎo)時(shí)間的pRSETA-sqr融合蛋白表達(dá)。0：IPTG誘導(dǎo)空載體pRSETA的表達(dá)；M：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1~7：IPTG分別誘導(dǎo)0、2、4、5、6、7、8h?時(shí)pRSETA-sqr的表達(dá)。

圖7.?SQR原核表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot驗(yàn)證，M：分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1：pRSETA載體；2：pRSETA-sqr2融合蛋白。