[發明專利]人脂肪干細胞無血清基礎培養基

有效

• 申請號: 201210197360.6
• 申請日: 2012-06-15
• 公開（公告）號: CN102732477A
• 公開（公告）日: 2012-10-17
• 發明（設計）人: 焦陽
• 申請（專利權）人: 江蘇瑞思坦生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京商專永信知識產權代理事務所(普通合伙) 11400
• 代理人: 高之波;鄔玥

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種干細胞無血清基礎培養基。

背景技術

人脂肪干細胞即人體脂肪間充質干細胞（adipose-derived?stem?cells,ADSCs）是目前廣泛應用于組織工程及再生醫學領域的一種成體干細胞，與骨髓間充質干細胞一樣具有多向分化潛能。ADSCs呈成纖維細胞樣生長，胞漿和核仁豐富，呈平行或漩渦樣排列。細胞周期分析顯示G0/G1期的細胞占69%，S期占24%，G2/M期占8%。在胎牛血清的存在條件下傳代培養2-3天細胞增殖1倍。多次傳代(10-20代)后,細胞增殖速度無明顯減慢，在傳代6次后細胞群體中出現衰老細胞，第15代細胞群體中衰老細胞約占15%。ADSCs具有與骨髓間充質干細胞基本相同的細胞免疫表型，經流式細胞儀分析CD9,CD10,CD13,CD29,CD44,CD49d,CD49e,CD54,CD55,CD59,CD90,CD105,CD117,CD146,CD166,STRO-1均為陽性,而CD31,CD34,CD45均為陰性。最大的區別是ADSCs表達CD49d,不表達CD106,而正好相反,BMSCs表達CD106,不表達CD49d。

目前常用的ADSCs培養是利用飼養層細胞與采用含10%胎牛血清的培養基進行培養。這種培養干細胞方法的缺點是方法復雜，提取的干細胞數量少，純度不高，繼代增殖緩慢，更要緊的是使用飼養層細胞和動物血清容易導致干細胞污染，特別是動物血清內潛在動物源性內毒素或病毒將對人體健康構成極大地風險，這樣培養出的干細胞不適于直接應用于臨床。

發明內容

本發明的目的是提供一種人脂肪干細胞無血清基礎培養基，克服使用血清制備細胞培養基的缺點和風險。

在細胞培養中使用血清的缺點有很多例如血清成分復雜，雖含許多對細胞有利成分，也含有對細胞有害的成分，使血清有如下幾個明顯的缺點：

對大多數細胞，在體內狀態，血清不是它們接觸的生理學液體，只是在損傷愈合以及血液凝固過程中才接觸血清，因此使用血清有可能改變某種細胞在體內的正常狀態；

血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應（如精胺、亞精胺）形成有細胞毒性作用的聚精胺。補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡；

動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致；

取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性；

血清的使用使得實驗和生產的標準化困難，其中的蛋白質使得某些轉基因蛋白生物藥品生產中分離純化工作很難完成；

大規模生產中，血清來源越來越困難，價格昂貴，是構成動物細胞培養生產成本的主要部分之一。

一種人脂肪干細胞無血清基礎培養基使用血清替代劑，由高糖型DMEM基礎培養基、人血清白蛋白、轉鐵蛋白、?；撬帷⑦€原型谷胱甘肽、銅藍蛋白、L-抗壞血酸-2-硫酸酯、α-生育酚琥珀酸單酯、亞油酸、α-酮戊二酸和硒組成。人血清白蛋白優選濃度為0.25~2.0mg/mL、轉鐵蛋白優選濃度為1.25~10.0μg/mL、?；撬醿炦x濃度為0.25~3.0μg/mL、還原型谷胱甘肽優選濃度為2~15μg/mL、銅藍蛋白優選濃度為0.1~0.35U/mL、L-抗壞血酸-2-硫酸酯優選濃度為10~150μg/mL、α-生育酚琥珀酸單酯優選濃度為10^-715×10^-7mol/L、亞油酸優選濃度為1.25~10.5μg/mL、α-酮戊二酸優選濃度為1×10^-5~2×10^-4mol/L和硒優選濃度為1.25~10.0ng/mL。人血清白蛋白最優濃度為1.25mg/mL，轉鐵蛋白最優濃度為6.25μg/mL，?；撬嶙顑灊舛葹?.25μg/mL，還原型谷胱甘肽最優濃度為10μg/mL，銅藍蛋白最優濃度為0.25U/mL，L-抗壞血酸-2-硫酸酯最優濃度為50μg/mL，α-生育酚琥珀酸單酯最優濃度為9×10^-7mol/L，亞油酸最優濃度為5.35μg/mL，α-酮戊二酸最優濃度為1×10^-4mol/L，硒最優濃度為6.25ng/mL。

其中各組分作用如表1：

表1：本發明使用的試劑及其作用