[發(fā)明專利]一種抗草甘膦EPSP合成酶GmEPSPS及其編碼基因與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210196502.7
• 申請(qǐng)日: 2012-06-14
• 公開（公告）號(hào): CN102766609A
• 公開（公告）日: 2012-11-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 雷開榮;李新海;謝樹章;翁建峰;林清;楊小艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院;中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，涉及一種抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種人工改造合成的抗草甘膦EPSP合成酶及其編碼基因GmEPSPS，以及含有該基因的表達(dá)載體及其在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物研制方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

草甘膦是一種內(nèi)吸傳導(dǎo)非選擇性、廣譜滅生性除草劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、低毒、低殘留、易被微生物分解，不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。其相關(guān)作用機(jī)理是由于草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的類似物，因此草甘膦、莽草酸-3-磷酸、EPSP合成酶容易結(jié)合形成EPSP-S3P-草甘膦復(fù)合體（此復(fù)合體非常穩(wěn)定），阻止PEP與EPSP合成酶的結(jié)合，這樣草甘膦就競(jìng)爭(zhēng)性抑制莽草酸途徑中5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）的活性，干擾生物體內(nèi)芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，導(dǎo)致生物死亡。

植物可以通過轉(zhuǎn)化導(dǎo)入對(duì)草甘膦具有耐受能力的EPSPS基因而獲得抗草甘膦的能力。根癌農(nóng)桿菌CP4、熒光假單胞菌G2和沙門氏菌CT7的EPSPS已經(jīng)在植物中得到廣泛的驗(yàn)證和應(yīng)用。隨著抗除草劑基因克隆的發(fā)展，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼問世并大面積推廣應(yīng)用，這些轉(zhuǎn)基因作物具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）所用除草劑品種廣譜、選擇性強(qiáng)、對(duì)環(huán)境友好、使用方便，特別適用于少耕與免耕體系，加強(qiáng)了水分保持，大大減少了土壤流失，并形成了有機(jī)物質(zhì)來鎖住土壤碳并減少二氧化碳排放；同時(shí)減少機(jī)械耕作，節(jié)約燃料能源；（2）減少除草劑總使用量，使防治雜草費(fèi)用下降，有效地降低農(nóng)業(yè)成本，增加農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益；（3）解決了常規(guī)除草劑難以防治的特殊雜草問題，如稻田的野生稻、赤稻、寬葉臂形草、圓葉牽牛；小麥田的雀麥、莎草；大豆田的鴨趾草、純?nèi)~決明以及寄生雜草；（4）解決土壤長(zhǎng)殘留性除草劑對(duì)后茬作物的傷害。轉(zhuǎn)基因作物所使用的草甘膦無(wú)土壤殘留，故對(duì)后茬作物十分安全。

從1996年轉(zhuǎn)基因作物首次商業(yè)化至今，耐除草劑性狀始終是轉(zhuǎn)基因作物的主要性狀。在2011年，轉(zhuǎn)基因作物耐除草劑性狀被運(yùn)用在了大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜以及苜蓿中，種植面積為9390萬(wàn)公頃，占全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積的59%，比占全球轉(zhuǎn)基因作物面積15%的抗蟲品種（2390萬(wàn)公頃）高出很多，這其中大部分為抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種。因此近年來包括美國(guó)和中國(guó)在內(nèi)的國(guó)家草甘膦產(chǎn)量急劇增加還與系列轉(zhuǎn)基因抗草甘膦品種的選育和大面積推廣有直接的關(guān)系。

我國(guó)在轉(zhuǎn)基因草甘膦作物方面的研究已取得一定進(jìn)展，但目前尚無(wú)轉(zhuǎn)抗草甘膦基因作物進(jìn)入商品化階段的報(bào)道。中國(guó)發(fā)明專利03826892.2公開的一種來源于熒光假單胞菌（Pseudomonas?fluorescens）的抗草甘膦基因（EPSPS基因），但由于其來源于細(xì)菌，細(xì)菌密碼子偏好性與植物有較大差異，將來自細(xì)菌的EPSPS基因直接轉(zhuǎn)化植物，其表達(dá)效率較低，因此，本領(lǐng)域有必要對(duì)來自微生物的抗草甘膦基因進(jìn)行人工改造，以保證抗草甘膦基因能夠在植物體內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種抗草甘膦蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)，名稱是GmEPSPS，（a）或（b）或（c）：

（a）由序列表中序列1的第73-504位所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

（b）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

（c）將（a）或（b）的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有草甘膦抗性的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

其中，（a）所限定的蛋白為GmEPSPS的成體蛋白，不含轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列；（b）所限定的蛋白為5′端帶有矮牽牛CTP4葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的GmEPSPS的中間體蛋白。

上述（c）中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述（c）中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變。

序列表中序列1由504個(gè)氨基酸殘基組成。

為了便于GmEPSPS蛋白的純化，可在由序列表中序列1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如下表所示的標(biāo)簽。

表：標(biāo)簽的序列