[發(fā)明專(zhuān)利]一種紫云蛤科貝類(lèi)線(xiàn)粒體COI基因擴(kuò)增引物

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210194552.1
• 申請(qǐng)日: 2012-06-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102776182A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-11-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 于貞貞;李琪;孔令鋒
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)海洋大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種紫云蛤科線(xiàn)粒體COI[the?cytochrome?c?oxidase?I]基因的擴(kuò)增引物。?

背景技術(shù)

紫云蛤科(Corbiculacea)隸屬于雙殼綱(Bivalvia)，異齒亞綱(Heterodonta)，簾蛤目(Veneroida)，全部海產(chǎn)，廣泛分布于中國(guó)沿海，日本、菲律賓和印度洋。該科貝類(lèi)種類(lèi)較多，中國(guó)已知約25種，通常埋棲于潮間帶至淺海細(xì)沙或泥沙質(zhì)海底。紫云蛤科的貝類(lèi)多數(shù)肉質(zhì)鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。例如，中國(guó)紫蛤、雙線(xiàn)紫蛤、紫彩血蛤和尖紫蛤都是名貴的海珍品。然而由于紫云蛤科種類(lèi)的貝殼外部形態(tài)高度可塑性和外套竇形態(tài)高度相似性，利用形態(tài)特征對(duì)紫云蛤科進(jìn)行物種分類(lèi)和系統(tǒng)發(fā)育的分析變得異常困難，特別對(duì)于一些親緣物種，單利用形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)很難區(qū)分開(kāi)來(lái)。而且，近年來(lái)由于過(guò)度捕撈等原因，其種質(zhì)資源已明顯消退，紫云蛤種質(zhì)資源合理利用和保護(hù)亟不可待。?

關(guān)于紫云蛤的增養(yǎng)殖和生物學(xué)特征等方面研究已有報(bào)道，但是基于分子標(biāo)記的遺傳多樣性的研究開(kāi)展較少，這種現(xiàn)狀極大的阻礙了紫云蛤種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用和保護(hù)。線(xiàn)粒體DNA(Mitochondrial?DNA，mtDNA)因其單親遺傳、無(wú)重組、中性進(jìn)化等特性，在分子遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。其中，COI基因作為進(jìn)化速率相對(duì)較快的區(qū)域，在無(wú)脊椎動(dòng)物系統(tǒng)分類(lèi)、種類(lèi)鑒別、群體遺傳多樣性和分子進(jìn)化方面得到廣泛應(yīng)用，已成為區(qū)分物種和研究物種進(jìn)化關(guān)系的理想基因。因此，利用mtCOI基因?qū)ψ显聘蚩七M(jìn)行物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析是一種很好的方法。?

由于Folmer(1994)設(shè)計(jì)的通用引物COIL1490和COIH2198在紫云蛤中擴(kuò)增結(jié)果不理想(即瓊脂糖電泳檢測(cè)大部分個(gè)體無(wú)擴(kuò)增條帶)，因此，開(kāi)發(fā)研究紫云蛤科線(xiàn)粒體COI基因擴(kuò)增專(zhuān)用引物，對(duì)利用分子方法鑒定紫云蛤科物種和進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析具有重要的意義，同時(shí)也能為利用COI基因保護(hù)紫云蛤科種質(zhì)資源提供技術(shù)條件。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種紫云蛤科線(xiàn)粒體COI基因適用性好的擴(kuò)增引物，它能滿(mǎn)足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。?

本發(fā)明根據(jù)紫云蛤科物種mtCOI序列變異度較高和非特異性擴(kuò)增引物擴(kuò)增效率低的特性，通過(guò)重復(fù)試驗(yàn)篩選出紫云蛤科mtCOI基因的擴(kuò)增引物。采用本發(fā)明的紫云蛤科線(xiàn)粒體mtCOI基因的擴(kuò)增引物，可以有效的擴(kuò)增出紫云蛤科不同物種的COI序列，對(duì)于利用COI序列研究紫云蛤科的物種分類(lèi)、系統(tǒng)發(fā)育、系統(tǒng)地理學(xué)和保護(hù)紫云蛤科種質(zhì)資源具有重要意義。?

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的紫云蛤科線(xiàn)粒體COI基因的擴(kuò)增引物的篩選方法采用三個(gè)步驟：a、利用COI?通用擴(kuò)增引物(LCO1490F和HCO2198R，F(xiàn)olmer?1994)擴(kuò)增出部分紫云蛤科物種的COI序列；b、從上述得到的部分紫云蛤科COI序列中，通過(guò)比對(duì)找出保守的序列片段，合成多套擴(kuò)增引物序列；c、從合成的多套擴(kuò)增引物序列中篩選出擴(kuò)增紫云蛤科線(xiàn)粒體COI基因效果最好的一對(duì)引物。?

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明：?

1.樣品采集：于2002年～2010年，從中國(guó)南北沿海共采集紫云蛤科4個(gè)屬10個(gè)種類(lèi)的200個(gè)個(gè)體。?

2.DNA提取：用苯酚-氯仿法對(duì)所采集樣品進(jìn)行DNA提取。?

COI通用擴(kuò)增引物擴(kuò)增：利用Folmer于1994年設(shè)計(jì)的COI通用擴(kuò)增引物?

LCO1490F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’?

HCO2198R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’?

對(duì)上述采集的紫云蛤科200個(gè)個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。不同物種的PCR熱循環(huán)退火溫度不同，退火溫度范圍為42～56℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5倍的瓊脂糖電泳檢測(cè)后，送往測(cè)序公司進(jìn)行雙向測(cè)序。用Lasergene軟件將測(cè)得的序列進(jìn)行人工矯正。最終獲得5個(gè)種類(lèi)64個(gè)個(gè)體的COI序列，其長(zhǎng)度約為650bp，其余個(gè)體均未擴(kuò)增出。?

3.序列比對(duì)：利用CLUSTALW軟件將上述測(cè)得的64個(gè)個(gè)體的COI序列進(jìn)行比對(duì)，找出比較保守、堿基變異度最小的序列片段。?

4.引物合成：根據(jù)上述的比對(duì)結(jié)果，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer?Primer5在堿基變異度最小的序列片段設(shè)計(jì)出3對(duì)擴(kuò)增引物。?