[發明專利]一種谷胱甘肽-S轉移酶(GST)蛋白在降解多種農藥中的應用

有效

• 申請號: 201210193065.3
• 申請日: 2012-06-13
• 公開（公告）號: CN103170089A
• 公開（公告）日: 2013-06-26
• 發明（設計）人: 于彩虹;汪未申;陳敏;黃瑩;張春輝;何緒文
• 申請（專利權）人: 中國礦業大學(北京)
• 主分類號: A62D3/02
• 分類號: A62D3/02;A62D101/28
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種GST蛋白在降解多種農藥中的應用。?

背景技術

化學農藥是農業不可缺少的生產資料，每年有數以百萬噸的農藥應用到農田中，然而僅有小于5％農藥真正能到達靶標生物，剩余的大部分則沉積到農田和非靶標生物當中。有相當一部分的農藥具有難降解、容易在環境中累積的特點，在斯德哥爾摩公約中提到的15中持久性有機污染物(Pops)中，有9種為農藥。農田農藥污染物的存在直接影響到農牧業生產。同時，農藥會隨著糧食、蔬菜、水果中的殘留進入人體進而影響人類的身體健康。近年來隨著人民生活水平的提高，如何有效地降解農田環境中農藥殘留物，減少其對環境的負面影響，成為重要課題。其中生物修復對于清除農藥的殘留和污染起著重要的作用。生物修復是通過活的生物來降解和轉化有毒的有機污染物。生物對有機污染物的降解過程都是在生物催化劑酶的參加、催化和調控下進行的。所有的生物都具有生物轉化酶和解毒酶，這些酶系在生物體的生命活動中起重要作用。在農藥化學品對生物產生影響的過程當中，解毒酶系對于生物體減少外來有毒物質的影響是非常重要的，可將有毒的、脂溶性的有機及外來物質轉化成低毒、水溶性的易被生物排泄的代謝產物。?

微生物繁殖迅速、利于培養、可以在逆境中生存并進行代謝，早已成為環境污染生物修復的主力軍，對多種農藥亦有降解作用。展開其相關酶系的研究，建立工業化的微生物降解技術具有極大的應用前景。在對微生物的相關酶系的研究中，谷胱甘肽S轉移酶(GST)是重要的二相解毒酶。二相解毒酶即催化還原型谷胱甘肽(GSH)、UDP-葡萄糖醛酸或氨基乙酸與活性外源毒性物質相結合，使其變為水溶性較高的內源性物質，以便機體將其進一步降解或排出體外。?

在公開號為CN101948817的專利申請中，申請人從農藥廠周邊土壤中篩選得到了一株可高效降解乙酰甲胺磷農藥的細菌，經16S?RNA鑒定為Stenotrophomonas?sp.。該菌株已于2010年9月保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號CGMCC?No：4152。依據常規分子生物學試驗方法，從菌株中提取基因組后，以下述引物：?

SPGST1?UP：TCGCGGATCCAATGCTGGAACTGTACGGAAAG；?

SPGST1?DN：TCGCCTCGAGCTATCAGGCCACGCCGTTGTCGAC?

進行PCR擴增，得到605bp大小的核酸片段，將其轉入pet28a載體中，轉入大腸桿菌中表達，得到了一個約28KDa大小的蛋白，該蛋白尾部因為pet28a載體的編碼，帶著一個6個精氨酸組成的親和尾巴，因此可以由Ni-NTA親和柱純化，并由高濃度咪唑洗脫下來。該GST蛋白?屬于GST超家族，是參與多種解毒機制的二項解毒酶。在本發明中，將克隆表達得到的GST蛋白用于對多種農藥的降解作用，研究其對廣譜性農藥的作用機理。?

發明內容

本發明的目的是提供一種GST蛋白用于多種農藥降解的應用。?

為實現本發明的目的，本發明的GST蛋白具有如下的氨基酸序列：?

MLELYGKPTSINVRKVLWLCAGLDLPLHHEPAPPADLLATLNPNRQVPVLRDGEFVLWESNSICRYLASRAGRDDLLPRAAQDRARVEQWMDWQASDLNSAWRHVFMARVRQHPDYPDDARAEASLAQWNRLMGVLDAQLAAGGYAAGSTFTLADIVLGLSTQRWRSTPGHTPALAHGGAWFERLRQQPGFAEHVDNGVSD?

本發明提供該GST蛋白對多種農藥的降解作用應用，其中所述農藥是S-氰戊菊酯、甲基硫菌靈、毒死蜱、馬拉硫磷、辛硫酸、吡蟲啉、二甲戊靈、苯磺隆、高效氯氰菊酯、乙草胺、戊唑醇之一。?

本發明還提供上述GST蛋白對多種農藥降解作用的應用，其檢測方法為HPLC法，檢測條件為流速1ml/分鐘，檢測波長215～295nm，依據不同農藥的紫外吸收光譜不同，檢測時的檢測波長應進行適應性調整。?

農藥降解率按下式計算：?

w＝(1-m/m0)×100％?

w-降解率。?

m0-對照組中的農藥峰面積。?

m-酶反應組中的農藥峰面積。?

附圖說明

圖1為PCR擴增605bp大小的GST片段?

圖2為將GST目的片段插入載體pet28a中結構示意圖?