[發(fā)明專利]一種無選擇標(biāo)記載體及應(yīng)用該載體培育高含類黃酮和咖啡酰奎尼酸的馬鈴薯的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210192877.6
• 申請(qǐng)日: 2012-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN102690840A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 丁新華;儲(chǔ)昭輝;代麗麗;馬連杰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種以馬鈴薯塊莖特異表達(dá)基因patatin的啟動(dòng)子、擬南芥AtMYB12基因和Cre/lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)構(gòu)建pX6-patatin::AtMYB12無選擇標(biāo)記載體，同時(shí)利用一個(gè)相對(duì)于前人更簡單有效的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因轉(zhuǎn)入馬鈴薯品種Desiree中，獲得無選擇標(biāo)記的高含類黃酮和咖啡酰奎尼酸的馬鈴薯。?

背景技術(shù)

擬南芥R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子AtMYB12為類黃酮生物合成的特異激活子，在擬南芥中可以增加類黃酮含量的積累。Luo等將該基因轉(zhuǎn)化到番茄中，發(fā)現(xiàn)蘆丁和山奈酚-蕓香糖苷含量比對(duì)照增加了65倍，總的黃酮醇，積累量達(dá)到了72mg/g?DW。?

類黃酮(Flavonoid)又稱黃酮類化合物，是一類具有“黃烷核”基本骨架的低分子量多酚類物質(zhì)的總稱。黃烷核由2個(gè)芳香環(huán)(A環(huán)和B環(huán))通過1個(gè)中央三碳鏈(可能形成雜環(huán)C環(huán))連接而成。根據(jù)B環(huán)的連接位置、中央三碳鏈的氧化程度以及中央三碳鏈?zhǔn)欠駱?gòu)成環(huán)狀等特點(diǎn)，可以把黃酮類化合物分為6大類：黃酮類、黃酮醇類、黃酮酮類、兒茶精類、異黃酮類、花青素類。類黃酮廣泛存在于各種植物中，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗骨質(zhì)疏松、抗腫瘤等功能。在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、飼料、化工等領(lǐng)域有著重要的應(yīng)用價(jià)值。?

除了植物中普遍存在的花色苷外，黃烷酮，黃酮醇，黃酮等其他類黃酮物質(zhì)在馬鈴薯塊莖，花，葉，種子中也均被發(fā)現(xiàn)，但是含量極低。Lewis等運(yùn)用HPLC法對(duì)26種有色馬鈴薯栽培品種的塊莖，花，葉中主要的酚類化合物的含量進(jìn)行了測定。花中類黃酮含量最高，達(dá)到1000-3000μg/g，其次為葉，為500-2000μg/g，塊莖中最低，為200-400μg/g，且塊莖肉中僅有0-30μg/g。塊莖中的類黃酮種類主要為黃烷酮、柚皮素、圣草酚、兒茶酸和表兒茶酸。最常見的槲皮素、蘆丁、山奈酚和山奈酚蕓香苷等黃酮醇在塊莖中痕量存在。?

綠原酸(Chlorogenic?acid)，是由咖啡酸(Caffeic?acid)與奎尼酸(Quinic?acid，1-羥基六氫沒食子酸)生成的縮酚酸，是植物體在有氧呼吸過程中經(jīng)莽草酸途徑產(chǎn)生的一種苯丙素類化合物。根據(jù)咖啡酰在奎尼酸上的結(jié)合部位和數(shù)目不同，從理論上講，單咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所組成的綠原酸異構(gòu)體共有10種，分別為：1-咖啡酰奎尼酸、3-咖啡酰奎尼酸、4-咖啡酰奎尼酸、5-咖啡酰奎尼酸、1，3-二咖啡酰奎尼酸、1，5-二咖啡酰奎尼酸、1，6-二咖啡酰奎尼酸、3，4-二咖啡酰奎尼酸、3，5-二咖啡酰奎尼酸、4，5-二咖啡酰奎尼酸。到目前為止，從植物中發(fā)現(xiàn)的綠原酸異構(gòu)體有如下：綠原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隱綠原酸(Band510(4-咖啡酰奎尼酸)、新綠原酸(5-咖啡酰奎尼酸)、異綠原酸A(4，5-二咖啡酰奎尼酸)、異綠原酸B(3，4-二咖啡酰奎尼酸)、異綠原酸C(3，5-二咖啡酰奎尼酸)、萊薊素(1，3-二咖啡酰奎尼酸)。本研究中涉及的5-咖啡酰奎尼酸均稱為綠原酸。?

綠原酸的生物活性：綠原酸被認(rèn)為是眾多藥材和中成藥抗菌解毒、消炎利膽的主要有效成分，通常被作為定性甚至定量的指標(biāo)。據(jù)報(bào)道，綠原酸的主要生物活性有(1)對(duì)透明質(zhì)酸酶及葡萄糖-6-磷酸酶的抑制作用；(2)對(duì)自由基的清除及抗脂質(zhì)過氧化作用；(3)抗誘變作用；(4)保肝利膽作用；(5)抗菌、抗病毒及解痙等作用。?

馬鈴薯是重要的糧食作物之一，屬于茄科，同源四倍體，應(yīng)用雜交育種的方法改良品種比較困難，同時(shí)馬鈴薯塊莖中多酚類化合物含量非常低。在培育馬鈴薯品種的研究中，營養(yǎng)品質(zhì)是馬鈴薯品種改良的一個(gè)主要目標(biāo)，利用基因工程技術(shù)有較大的優(yōu)勢(shì)，因其可以通過塊莖無性繁殖，將轉(zhuǎn)基因特性傳遞給后代而無需經(jīng)花培純化或多代選育。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化體系也日趨成熟，但仍存在基因性限制、轉(zhuǎn)化率較低的問題。?