[發(fā)明專利]用免疫熒光染色處理大豆根尖觀察細(xì)胞微管骨架的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201210191444.9
• 申請(qǐng)日: 2012-06-11
• 公開（公告）號(hào): CN102692497A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊靜;李成云;朱有勇;劉林;施竹鳳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/533
• 分類號(hào): G01N33/533
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用免疫熒光染色處理大豆根尖觀察細(xì)胞微管骨架的方法，具體涉及一種利用免疫熒光染色法處理大豆根尖觀察根尖細(xì)胞微管骨架的方法，屬于植物保護(hù)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

病原菌與其寄主互作被認(rèn)為是一場(chǎng)軍備競(jìng)賽，在這場(chǎng)競(jìng)賽中，病原菌通過各種策略克服或抑制寄主防御反應(yīng)，而寄主本身也利用各種策略識(shí)別和攻擊入侵的病原菌或病原菌效應(yīng)分子。病原菌與非寄主互作和與寄主互作間的定義差異是病原菌克服一系列障礙成功侵入寄主的能力。植物細(xì)胞骨架經(jīng)常被認(rèn)為是病原菌侵入寄主的一道障礙之一。細(xì)胞骨架在抵御病原菌入侵過程中的重要性可以通過一些例子說明，如大麥、小麥、黃瓜和煙草的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架被破壞后能被許多非寄主真菌穿透。病原菌成功侵入寄主通常需要經(jīng)過6道障礙。越來越多的證據(jù)表明，細(xì)胞骨架參與的是寄主受病原菌侵入時(shí)形成的第3道障礙，主要是誘導(dǎo)諸如乳突和胼胝質(zhì)形成、蛋白和碳水化合物積累甚至過敏性細(xì)胞死亡等障礙的生成。植物細(xì)胞骨架由肌動(dòng)蛋白纖絲和微管組成、作為胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)拈g接者扮演著至關(guān)重要的作用。二十世紀(jì)九十年代早期報(bào)道了第一例描述植物防御反應(yīng)中細(xì)胞骨架作用的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到病原菌侵入時(shí)，大量的寄主細(xì)胞極性化。在受到病原菌侵入的植物細(xì)胞中，觀察到細(xì)胞質(zhì)聚集點(diǎn)與細(xì)胞核移動(dòng)方向一致，即都向侵入點(diǎn)移動(dòng)。Kobayashi等人利用免疫細(xì)胞化學(xué)的方法研究非寄主病原豌豆白粉菌(Erysiphe?pisi)侵染大麥時(shí)的大麥胚芽鞘細(xì)胞微管組織結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在沒有受到病原菌侵染的寄主細(xì)胞中，微管沿著細(xì)胞的縱軸成橫向排列，而在被病原菌侵染的細(xì)胞中，微管在侵入點(diǎn)聚集成放射網(wǎng)狀。利用同樣的免疫熒光技術(shù)也在一系列的包括亞麻與亞麻銹菌、大豆與大豆疫病菌、洋蔥與蔥腐葡萄孢以及大麥與大麥白粉菌在內(nèi)的寄主與病原菌親和互作中觀察到寄主的微管和肌動(dòng)纖絲朝著真菌和卵菌侵入點(diǎn)重新分布和排列。大麥胚芽鞘細(xì)胞與大麥非致病白粉菌互作相比，大麥胚芽鞘細(xì)胞與致病白粉菌的親和互作中微管和肌動(dòng)蛋白纖絲重新排列的速度明顯減緩，同樣對(duì)其它致病系統(tǒng)的研究也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果，明顯的證據(jù)支持了植物細(xì)胞骨架在植物防御反應(yīng)中的作用，同時(shí)也表明親和病原菌會(huì)干擾細(xì)胞骨架的重新排列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)不足，而提供一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地用免疫熒光染色方法觀察大豆根尖細(xì)胞微管骨架的方法。

發(fā)明的技術(shù)方案是：

保持現(xiàn)有免疫熒光染色和觀察方法不變，包括熒光抗體種類和用量、所用共聚焦顯微鏡的激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)范圍均與常規(guī)相同，用免疫熒光染色方法處理1-10天的大豆根尖，共聚焦顯微鏡觀察根尖皮層細(xì)胞微管骨架；所述免疫熒光染色方法處理方法為：將大豆根尖放入固定液抽氣10min，室溫固定1hr；固定完畢后用PEMT洗三次，每次10min；37℃條件下酶解1hr；酶解后PEM沖洗三次，每次10min；用0.1M?PBS(pH7.2)溶液配制NaBH4，使其濃度為1mg/ml，再用配制好的1mg/ml的NaBH4處理大豆根尖20min；室溫用50mM?Gly封閉30min；加一抗，4℃過夜，沖洗一抗：PBS沖洗三次，每次10min；加二抗(1∶600)，37℃、閉光條件下，3hr；沖洗二抗：PBS沖洗三次，每次10min；加上抗熒光淬滅劑后，封片。

本發(fā)明的有益效果在于：

方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速。利用免疫熒光染色的方法處理大豆根尖，共聚焦顯微鏡觀察根尖皮層細(xì)胞微管骨架，能直接定性地掌握大豆根尖細(xì)胞微管骨架排列方式。免疫熒光染色法直接處理和觀察水稻根尖細(xì)胞微管骨架排列能有效避免諸如免疫熒光染色處理和觀察葉片細(xì)胞微管骨架時(shí)步驟繁瑣且容易受到殘留葉綠素的干擾，同時(shí)為進(jìn)一步研究土壤病原菌與植物根組織互作時(shí)細(xì)胞微管骨架對(duì)病原菌響應(yīng)的觀察提供有效簡(jiǎn)單的方法。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例一：

免疫熒光染色法處理1天的大豆根尖，共聚焦顯微鏡觀察根尖皮層細(xì)胞微管骨架。