[發明專利]布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別

無效

• 申請號: 201210190050.1
• 申請日: 2012-06-11
• 公開（公告）號: CN102772794A
• 公開（公告）日: 2012-11-14
• 發明（設計）人: 鐘旗;易新萍;王力儉;谷文喜;葉鋒;劉麗婭;李延濤;吳冬玲;馬曉菁;吐爾洪·努爾;姚剛;范偉興
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院獸醫研究所
• 主分類號: A61K39/10
• 分類號: A61K39/10;A61P31/04;G01N33/53;G01N33/531;G01N33/543;C12N15/70;C12R1/19;C12R1/01
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

技術領域

本發明涉及布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用及其免疫學鑒別，尤其是布魯氏菌病A19分子標記疫苗的(A19-ΔVirB12)免疫保護力及應用，建立免疫學方法解決了免疫動物與臨床患病動物難以鑒別的問題，屬于獸用生物制品領域。

背景技術

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的世界各地廣泛流行的人畜共患傳染病。對布魯氏菌病的預防和根除，已經成為眾多國家和地區公共衛生安全防御體系的主要任務。

在多數布病流行的國家和地區，控制家畜布病的主要手段仍是使用疫苗接種進行免疫，因此，疫苗免疫是預防和控制畜間布魯氏菌病的主要措施和最有效的手段。目前我國使用的弱毒菌疫苗有牛A19、羊M5和豬S2；國外使用的弱毒菌疫苗有牛S19和RB51、羊Rev1；S19由美國研發，我國從前蘇聯引進，不缺失Ery基因，命名為A19。加拿大、澳大利亞、美國等幾個宣布布病消滅的國家，主要采用以弱毒疫苗免疫為主的綜合防控措施。

縱觀布魯氏菌免疫制劑研究歷史我們發現，布魯氏菌弱毒苗一直處于主導地位，對布魯氏菌的防治起到很大的作用，但是同時也帶來一些隱憂，首先，現用的布魯氏菌疫苗均為弱毒活菌疫苗，容易感染人，對人類健康存在威脅。其次，疫苗缺乏鑒別診斷標記，疫苗接種動物與自然患病動物無法甄別，造成患病動物在自然群體中長期存在，嚴重危害人類和動物的健康，阻礙動物魯氏菌病的根除和凈化。

隨著分子生物學技術的發展，基因敲除技術成為目前解決弱毒疫苗毒力強、無法用免疫學方法區分疫苗免疫和自然感染等難題的一項重要技術。為解決布魯氏菌病弱毒疫苗中存在的上述問題，本發明通過分子生物學技術構建出缺失VirB12蛋白的牛布魯氏菌病分子標記苗，缺失的VirB12蛋白能刺激機體產生有診斷意義的抗體，并且不改變A19疫苗的免疫原性和生物學特性，用免疫學方法可以區分疫苗免疫抗體和自然感染抗體，彌補現有A19苗的缺陷，對全面提升國產弱毒菌疫苗的性能，發揮國內自主產權的布魯氏菌弱毒菌疫苗作用的意義重大，為動物布病防控提供新的疫苗。

發明內容

本發明的目的是提供一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗應用及其免疫學鑒別，應用該布魯氏菌病A19分子標記疫苗后可提供間接酶聯免疫吸附試驗(iELISA)區分該疫苗接種的動物與野毒感染動物。本發明以牛為防疫布魯氏菌病的實驗靶動物，應用布魯氏菌病A19-ΔVirB12標記疫苗免疫牛，評價該分子標記苗的免疫保護力。利用該分子標記苗中缺失的VirB12蛋白作抗原包被酶標板，以健康非免疫牛免疫為陰性對照，自然感染的布病陽性牛免疫為陽性對照，以辣根過氧化物酶標記的兔抗牛IgG為二抗，建立了鑒別布魯氏菌病A19-ΔVirB12免疫動物與野毒感染動物的iELISA方法。本發明提供的布魯氏菌病A19-ΔVirB12標記疫苗不僅對牛布魯氏菌病具有好的免疫保護力，而且發明的iELISA方法解決了免疫動物與臨床患病動物難以鑒別的問題，對牛布魯氏菌病的防控、根除和凈化具有實際應用價值。

本發明所述的一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的應用，以500億CFU的牛布魯氏菌病A19-ΔVirB12疫苗活菌皮下注射免疫4-6月齡犢牛。

一種布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別，以布魯氏菌病A19疫苗為起始原料，制備牛布魯氏菌VirB12抗原蛋白具體操作按下列步驟進行：

a、根據布魯氏菌A19的VirB12基因設計引物，VirB12基因的一對特異性引物為：

VirB12F：5′-CATATGCGCACATTGGTTATGGTC-3′含NdeI酶切位點；VirB12R：5′-GTCGACTTACTTGCGTAAAATTTC-3′含Sal?I酶切位點；

b、從牛種布魯氏菌A19株提取細菌總DNA，以細菌總DNA為模板，將步驟a中設計的VirB12基因引物進行聚合酶鏈反應，獲得VirB12蛋白基因；

c、將步驟b中獲得VirB12蛋白基因轉入原核表達載體pET-28a(+)中，獲得重組表達載體；

d、將步驟c中重組表達載體導入大腸桿菌感受態細胞BL21(DE3)中，搖菌至OD₆₀₀＝0.5，以IPTG終濃度0.2mg/mL溫度37℃誘導表達4h，收集菌體制備VirB12抗原蛋白即可。

所述布魯氏菌病A19分子標記疫苗的免疫學鑒別中，步驟d中所述的制備VirB12蛋白能被非免疫布魯氏菌陽性牛血清所識別。