[發明專利]一種貝類snRNA U6基因及其引物和應用

有效

• 申請號: 201210189971.6
• 申請日: 2012-06-11
• 公開（公告）號: CN103484465A
• 公開（公告）日: 2014-01-01
• 發明（設計）人: 黃雯;闕華勇;許飛;李莉;張國范
• 申請（專利權）人: 中國科學院海洋研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/11;C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 馬馳

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體地說是一種貝類snRNA?U6基因的全序列及其引物應用于貝類microRNA的表達分析。?

背景技術

貝類，屬軟體動物門中的瓣鰓綱（或雙殼綱），常見的種類有牡蠣、貽貝、蛤、蟶等。現存種類1萬種左右，其中80％生活于海洋中。貝類中絕大多數種均可食用，很多貝類的肉質肥嫩，鮮美可口，營養豐富，具有很高的經濟價值，是世界上重要的水產養殖對象。?

MicroRNA（miRNA)是一類在生物界中廣泛存在的小分子非編碼單鏈RNA，長約21～24nt，它能通過降解或抑制互補的靶mRNA來進行轉錄后基因表達調控，并且在生物的各個發育時期和不同的組織器官中廣泛表達，參與到生物的各種生理活動中，因其在生物中的重要性，近幾年國內外科學家對miRNA的研究倍加重視。對貝類microRNA的研究有助于推動貝類養殖業的發展。貝類中只報導了65條microRNA（miRBase?18)，且暫時沒有可用于microRNA定量的內參基因報導。?

目前對miRNA的表達分析主要有大規模測序，基因芯片和實時熒光定量法。大規模測序和基因芯片法為高通量方法，成本很高，不適于少量miRNA的功能分析。而基于SYBR?Green染料熒光定量PCR的miRNA相對定量法，參見文獻：【Shi?R,Chiang?VL(2005)Facile?means?for?quantifying?microRNA?expression?by?real-time?PCR.Biotechniques?2550?39:519-525.】表達分析有著操作相對簡單，成本較低，靈敏度高的優勢，廣受研究人員的歡迎。而在相對定量中，內參的選擇尤為重要。?

目前內參的選擇大多數采用一些表達相對恒定的管家基因，如U6，5S?rRNA等。U6基因是一種核剪切子RNA，參與到pre-mRNA的加工剪切，它的序列比較保守，在不同的物種中同源性高，參見文獻【Brow?DA,Guthrie?C(1988)Spliceosomal?Rna?U6?Is?Remarkably?Conserved?from?Yeast?to?Mammals.Nature?334:213-218.】。但是目前在貝類中的U6基因序列尚未被克隆，也沒有基于貝類U6基因設計的引物。?

發明內容

本發明的目的是提供一種貝類microRNA定量的內參基因及其引物。即為基于熒光定量PCR的miRNA相對定量法表達分析中的內參基因及引物。?

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：?

一種貝類small?nuclear?RNA?U6基因，具有序列表SEQID?No:1中堿基序列。?

根據權利要求所述基因設計的一對內參引物，其特征在于：用于基于熒光定量PCR的miRNA相對定量法中，其以polyA加尾反轉的cDNA為模板的內參引物：?

Sense?primer：??5’?-CGGCAGTACATATATTAAAATTGGAACGA-3’?

Anti-sense?primer：??5’??-TGGAACGCTTCACGAATTTGCGTGTCATC-3’。?

所述基因或引物作為內參基因在相對定量法實時熒光定量PCR中的應用。?

所述基因或引物作為相對定量中的內參基因在實時熒光定量PCR的貝類microRNA表達分析中的應用，它們的作用在于校正上樣量，上樣過程中的實驗誤差，保證實驗的準確性。?

具體步驟為：?

a.候選miRNA序列的獲得：從已有數據庫或其它來源獲得欲做表達分析的miRNA序列。?

b.引物設計：根據獲得的候選miRNA序列設計該miRNA相應的特異引物(擴增產物單一，具體為溶解曲線峰單一，3％的瓊脂糖膠檢測條帶單一)。?

c.PCR模板的準備：在收集的樣品中用E.Z.N.A.^TM?miRNA?kit(試劑盒，市購于OMEGA公司)提取<200nt的small?RNA后，用One?Step?miRNA?cDNA?synthesis?Kit(試劑盒，市購于TaKaRa公司)按照說明書加polyA尾后反轉成cDNA。?

d.熒光定量PCR反應：用miRNA相應的特異引物和universal?reverse?primer(由上述TaKaRa試劑盒提供)以U6基因為內參在ABI?7500FASTreal-time?PCR儀中進行。?