[發明專利]抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）測定試劑盒（發色底物法）

有效

• 申請號: 201210189573.4
• 申請日: 2012-06-08
• 公開（公告）號: CN102690862A
• 公開（公告）日: 2012-09-26
• 發明（設計）人: 謝永華
• 申請（專利權）人: 上海太陽生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/56
• 分類號: C12Q1/56;C12P19/12
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發明涉及醫學體外診斷領域，特別涉及一種發色底物法檢測抗凝血酶III的試劑盒。

背景技術

抗凝血酶III（antithrombin?III，AT-III）是一種依賴于肝素的絲氨酸蛋白酶抑制劑，是一種重要的抗凝血因子，在血漿中承擔著60%~70%的抗凝血酶活性，在維持血液生理性凝血與抗凝血平衡中起著重要的作用。AT-III由肝臟、血管內皮細胞和巨核細胞合成，分子量約為60000Da，屬于α2-球蛋白，其基因位于第1號染色體（1p23）。

在血栓形成過程中，AT-III是一個非常重要的調節劑，在肝素的催化下，通過與凝血酶或凝血因子IXa、Xa、XIa、XIIa、纖溶酶等絲氨酸蛋白酶以1:1的比例形成復合物，從而使這些酶失去活性，發揮抗凝作用。

正常人AT-III的血漿濃度為20～30mg/dl，活性為80%～130%，波動范圍相對狹窄，當血液中AT-III水平低于正常范圍，則增加形成血栓的風險，是發生靜脈血栓和肺栓塞的常見原因之一。血液中AT-III缺乏可由多種原因造成，如AT-III合成降低，主要見于肝硬化、重癥肝炎、肝癌晚期等；AT-III丟失增加，見于腎病綜合癥；AT-III消耗增加，見于血栓前期和血栓性疾病，如彌散性血管內凝血（DIC）、心絞痛、心肌梗死等；先天性AT-III缺陷或異常。因此，AT-III在臨床診斷中是一個非常重要的指標。

目前，測定AT-III的方法主要分為三類：免疫學分析方法、凝固法和發色底物法。

免疫學分析方法是通過單向放射免疫擴散法、免疫比濁法以及酶聯免疫吸附法測定樣本中AT-III的濃度。這種方法比較特異和靈敏，但是操作繁瑣、耗時，由于該方法在測定AT-III過程中，非活性的AT-III也參與了免疫學反應，檢測的AT-III濃度并不能完全反映AT-III活性水平，這對于由于AT-III活性降低而導致的AT-III缺乏II型的病人，檢出的高值結果明顯是不合適的。

凝固法是通過血漿凝固時間直接或間接地測定樣本中AT-III活性，主要包括一步法和兩步法。一步法是將檢測樣本與AT-III缺乏的血漿混合，通過加入相應試劑激活外源性凝血途徑或內源性凝血途徑，測定凝固時間，與參考標準進行對照，從而求得AT-III的活性，該方法有多種蛋白酶參與反應，測定易受影響。兩步法是將血漿通過加熱進行脫纖維蛋白處理，再與過量的凝血酶孵育，殘余的凝血酶活性通過測定加入血漿或纖維蛋白原后的凝固時間而換算出樣本中AT-III的活性，該方法缺點在于操作比較繁瑣、費時，需要將血漿加熱變性進行脫纖維，從而會導致AT-III水平的降低。

發色底物法是在待測血漿中加入過量的凝血酶，在肝素存在下，凝血酶與血漿中的AT-III形成1:1復合物，剩余的凝血酶作用于底物，裂解出顯色基團，顯色程度與剩余凝血酶的量呈正相關，而與血漿中AT-III活性呈負相關。由于該方法靈敏度高、準確性好、檢測時間短，且能夠適用于多種自動化分析儀器，目前，臨床上已廣泛應用。但是該方法也存在一定的缺陷，該法是通過加入外源性凝血酶來分析樣本中AT-III活性，由于樣本中也存在另一個肝素催化的凝血酶抑制劑——肝素輔助因子II（HCII），因而測定剩余凝血酶的活性是凝血酶與AT-III和HCII反應后剩余的活性，這在HCII水平正常的病人，AT-III的缺乏將有可能由于HCII的抗凝血酶活性而掩蓋。因此，該法易受樣本中HCII的干擾而導致AT-III的測定不準確，尤其是在AT-III缺乏的樣本中。

有研究顯示，在肝素存在下HCII對凝血酶的抑制作用取決于離子強度。美國專利US5646007通過提高鹽的濃度，使凝血酶的構象發生變化，HCII對凝血酶測定的干擾降低，但凝血酶對發色底物的敏感度也隨之降低。

Demers等人（Thrombosis?and?Hemostasia，69（3），pp.231-235（1993））報道采用FXa替代凝血酶，不會受到HCII的抑制，但是用FXa分析價格更加昂貴，而且FXa不太穩定，分析時需要大量稀釋，不太適合自動分析儀。

發明內容

針對目前現有技術存在的缺陷，本發明的目的在于提供一種發色底物法檢測抗凝血酶III（AT-III）活性的試劑盒，該試劑盒抗干擾能力強、靈敏度高，具有廣泛的應用前景。